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 JoVE Clinical and Translational Medicine

당뇨병 연구에서 β-세포 질량 분포의 평가를위한 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 부근

*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 4, 1, 1

1Umeå Centre for Molecular Medicine, Umeå University, 2Cell Transplant Center, Diabetes Research Institute, University of Miami,, 3EMBL-CRG Systems Biology Program, Centre for Genomic Regulation, Catalan Institute of Research and Advanced Studies, 4Dept. of Computing Science, Umeå University

* These authors contributed equally
Article
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    Summary

    Cite this Article

    Eriksson, A. U., Svensson, C., Hörnblad, A., Cheddad, A., Kostromina, E., Eriksson, M., et al. Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research. J. Vis. Exp. (71), e50238, doi:10.3791/50238 (2013).

    Abstract

    가까운 적외선 (NIR) 스펙트럼 이미징의 기능을 포함 OPT을 조절함으로써, 우리는 여기서 이러한 쥐의 췌장 등의 췌장 조직의 이미지를 큰 기관에 가능성을 설명하고, 채널의 수 (셀 유형) 5 월을 높이기 위해 단일 표본에서 공부합니다. , 게시물에 대한 2 / 개선 알고리즘 표본의 (우리의 경우에 췌장) 회전 축에서 질량 중심 (COM) (AR) 2의 1 / 정확한 위치 : 우리는 더 이상 제공 계산 도구의 숫자의 구현을 설명 - 정렬 단층 재건 2, 3 / OPT 기반 BCM의 결정 3 노이즈 비율로 신호를 높이기 위해 강도 균등화를위한 프로토콜 동안 기하학적 왜곡을 방지 튜닝. 또한, 우리는 이미지 수집하는 동안 표본의 의도 움직임에 대한 위험을 최소화 샘플 홀더를 설명합니다. 함께,이 프로토콜은 BCM 유통 및 oth의 평가를 가능하게어 기능 Langerhans의 개별 섬의 수준에 해상도로, 그대로 pancreata 또는 다른 장기 (췌장 이식의 연구에 등)의 볼륨을 통해 다운을 수행 할 수합니다.

    Introduction

    β-세포를 생산 인슐린은 혈당 항상성을 제어 할 수있는 신체의 능력에 대한 열쇠입니다. 따라서 췌장 BCM 분포의 평가는 사전 임상 당뇨병 연구의 여러 분야에 필수적입니다. 예를 들어, 치료 정권의 평가에서, 질병에 대한 쥐 모델에서 내분비 세포 분화 또는 당뇨병 aetiology 연구에 타겟팅 된 유전자 절제의 영향은 종종 이러한 분석에 따라 달라집니다. 전통적으로, 평가 이러한 종류의 크기와 췌장의 복잡한 해부학 적 헌법으로 인해 수행하기 어려운 시간이 소요 stereological 접근 방법에 의존하고 있습니다. 현재의 대부분의 고해상도 이미징 방법은 (일반적으로 광학), 설치류에서 전체 췌장 이미징을 허용하기에 충분한 침투 깊이를 제공하지 않습니다. 반대로, 자신의 침투 깊이 (일반적으로 핵)에 의해 제한되지 않습니다 이미징 접근 방식은 전체 BCM 분포를 해결하기 위해 가난한 해상도로 제공하고 방해4,5 적절한 대비 요원의 부족에 의해.

    광학 프로젝션 단층 촬영은 cm 규모 6 mm에 생명 표본의 고해상도 평가를 수있는 3D 영상 양상이다. 이에, 공간적 위치와 Langerhans의 섬을 표현 개인 인슐린의 볼륨에 대한 정보는 정상과 당뇨병 생쥐 3,7-10에서 췌장의 볼륨에 걸쳐 추출 할 수 있습니다. 현재 연구의 목적은 더 췌장 β-세포의 평가를위한이 기술의 능력을 향상하는 것입니다, 다른 조직, 다른 췌장 성분 (예 : 셀 형식을 침투 등)과의 관계에 대형의 이식의 내생 배포, 이전에 가능한 것 췌장 준비.

    가까운 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 (NIR-OPT) 설치

    프로토콜, 최대 샤프에 의해 설명 원본 설정에 따라 OPT 스캐너 아래에서 1, 설명 및 사용됩니다. 마우스 췌장 (BCM의 예)의 단일 채널 평가를 들어, SkyScan 3001 (Bioptonics) 스캐너를 사용할 수 있습니다.

    650nm 위의 파장에서 수은 아크 램프보다 높은 여기 에너지를 제공하는 금속 할로겐화물 램프는 여기 빛을 공급하고 있습니다. 빛이 액체 빛이 가이드를 통해 전송됩니다. fluorochromes 및 NIR 형광 이미징 및 채널 분리 밴드 패스 필터의 유용한 조합은 그림 3에 표시됩니다. 방출 빛이 NIR 스펙트럼에서 높은 양자 효율, 다시 조명 CCD 카메라로 검출된다. OPT 스캔은 카메라를 제어 LabView 플랫폼 및 스테퍼 모터를 사용하여 자동화되어 있습니다. 그대로 쥐 pancreata, 보호 코팅은 거울 및 대형 큐벳의 크기 샘플을 지원하는 것은 사용됩니다. 마지막으로, 샘플 홀더 원치 않는 수직 movemen을 제거 그스캔하는 동안 샘플의 TS가 설계되었습니다.

    Protocol

    1. 샘플 준비 및 스캐닝

    1.1 샘플 준비

    이전 7에 설명 된대로 다음 절차는 본질적으로 수행됩니다.

    1. 췌장 수확. proteolytic 저하를 방지하기 위해 얼음처럼 차가운 PBS를 사용합니다.
    2. 2-3 시간을위한 얼음에 PBS에서 4% PFA의 조직을 수정합니다. 엽이 고정에서 "분산"되어 있는지 확인하십시오. 이 재건 한 후 해부학 적 랜드 마크의 식별을 용이하게합니다.
    3. 30 분에 초과 PBS에 씻으십시오.
    4. 메탄올의 stepwise 췌장 (33, 66 %, 100 %), 15 분 / 단계를 탈수. 이 (단계 5 참조) 표백하는 동안 거품의 형성을 최소화하고 (7 단계 참조) 냉동 해동시 세포 파괴를 방지 할 수 있습니다.
    5. H 2 O 2 : : DMSO는 내생 조직 형광을 해소하기 위해 24 시간에 대한 RT에서 2시 1분 3초 비율 버퍼를 표백 신선하게 조리 된 MeOH의 조직을 배양. 새로운 bleachi에 큰 샘플, 교류를위한또 다른 24 시간을위한 것이다 버퍼와 품다.
    6. ON, 초과 MeOH에 씻으십시오.
    7. -80에서 적어도 5주기위한 냉동 해동 ° C - RT 항체 침투를 촉진합니다.
    8. TBST (33, 66 %, 100 %), 15 분 / 단계로 stepwise을 Rehydrate.
    9. RT에서 12-24 시간 10 % 혈청 (바람직 보조 항체가 생성 된에서 동일한 종), 5 % DMSO와 0.01 % NaAz과 TBST에서 차단
    10. RT에서 48 시간에 대한 버퍼를 차단에 차 항체와 함께 배양, 큰 샘플 (여기서 사용하는 항체는 시약의 테이블에 나열되어 있습니다) 72 시간에 연장된다.
    11. ON, 초과 TBST에 씻으십시오.
    12. 48 시간에 휘황 복합 차 항체와 함께 배양, RT에서 큰 샘플 72 시간으로 연장된다.
    13. ON, 초과 TBST에 씻으십시오.

    1.2

    다음 절차는 (그림 7 참조 아가로 오스에있는 샘플을 탑재하고 맞춤 제작 샘플 홀더에 첨부하는 방법에 대해 설명합니다) 스캔을 선택을 취소하기 전에.

    1. Hörnblad 3 3A 그림에 따라, 지라 십이지장과 위의 엽 (叶)을 분리합니다. 엽 사이의 관계는 더욱 Hörnblad 11 명확히하고 있습니다.
    2. 1.5 % (w / V) DH 2 O, 필터의 낮은 녹는 온도 아가로 오스를 준비, 37로 냉각 할 수 있도록 ° C와 세제를 씻어과 얼음에 아가로 오스 - 삽입하기 전에 거품을 제거 할 DH 2 O의 조직을 씻어.
    3. 샘플을 둘러싸고 아가로 오스 블록을 잘라서 샘플 및 아가로 오스의 기초 사이에 ~ 1cm 스페이서를 두십시오. 빛의 분산을 줄이기 위해 아가로 오스 블록의 날카로운 가장자리를 (≤ 90 °) 트림.
    4. 시간이 각 단계 사이에 평형 수 있도록 MeOH (33, 66 %, 100 %)에서 stepwise 샘플을 탈수. 표본이 느낄 때 그것은 equilibrated로 간주됩니다.
    5. 벤질 벤츠 : 벤질 알코올의 1시 2분 솔루션에 샘플을 지우기oate은 (BABB)는 투명해질 때까지. 추가 12 시간에 대한 Exchange BABB 솔루션과 품다.
    6. 샘플 홀더에 지워 샘플을 배치하고 소유자의 플랜지에있는 교련 구멍을 통해 아가로 오스 스페이서를 통해 두 바늘을 삽입하여 고정하십시오.
    7. BABB 소요되는 솔루션으로 가득한 큐벳에 스캐너 및 잠수함 거기에 샘플을 배치합니다. pancreata 일련의를 비교하면 동일한 배율은 모든 검사에 사용되어야합니다. 배율은 시리즈 최대 규모의 샘플에 최적화해야합니다.

    AR의 표본 1.3 위치

    다음 프로토콜은 정확하게 COM-AR 알고리즘을 사용하여 샘​​플을 배치 할 수있는 절차에 대해 설명합니다. 투자 수익 (ROI)는 전체 표본을 포함하고있는 경우이 절차에만 적용 할 수 있습니다. 알고리즘에 대한 자세한 설명을 보려면 Cheddad 2 참조하시기 바랍니다.

    1. 봇 두 위치에서 시료의 이미지를 취득H 해부학 및 신호 채널. 가장 큰 프로젝션 공간과 90 ° (Z-축과 관련된)에서 2 순위를 표시하는 0 ° (X-축과 관련된)에 위치 1. 우리는 해부학을 시각화하기 위해 GFP 채널을 사용하고 있습니다.
    2. 임계 투자 수익 (ROI)을에 해부학 적 이미지에 기대 - 극대화 (EM) 알고리즘을 적용합니다.
    3. 0 °와 90 °의 계획 모두 2 단계에서 얻은 바이너리 이미지의 COM 포인트를 (X-좌표) 계산합니다.
    4. 0 °와 신호 채널의 90 ° 이미지에 대한 3 단계에서 계산 확인 된 COM 포인트를 통과 수직선을 비교하십시오.
    5. 참조 시야의 중심 라인은 샘플의 발견 COM 포인트 통과 수 있도록 샘플을 이동하는 등 4 단계에서 획득 한 이미지를 사용합니다.

    1.4 스캐닝

    1. satura 않고 가능한 잡음 비율이 가장 높은 신호를 달성하기 위해 노출 시간을 조정투영 이미지 팅은 어떤 공간을 갖추고 있습니다. 스캔 할 모든 채널에 대해 반복합니다.
    2. 스캔 할 첫 번째 형광 채널에 대한 필터 설정을 선택합니다. 짧은 λ의 fluorophores에서 배출 더 λ와 fluorophores을 자극함으로써 사진 표백 원인이 될 수 있습니다. 이러한 가능성을 최소화하려면 먼저 긴 여기 λ와 형광를 스캔합니다.
    3. 샘플을 조명하고 각 채널에 대한 수직 축을 따라 샘플을 회전, 360 ° 이상의 형광 신호를 수집하기 위해 셔터를 엽니 다. NIR-OPT 설정에 사용되는 단계 각도가 0.9입니다 °와 Bioptonics 3001 스캐너 0.45 °에.
    4. 다음 채널에 대한 적절한 필터를 선택하고 위 진행합니다.

    2. 전산 처리 및 재건

    2.1 포스트 수집 misalignment 감지 및 수정 (A-값 조정)

    프로젝션 단층 촬영에서는 일반적으로 필요합니다이전 재건에 회전 축을 따라 세부적으로 조정할 이미지의 위치로 예상에 후 정렬 값을 지정합니다. 그러나, 광학 축에 대한 카메라의 각도의 작은 수차 샘플의 길이를 따라 비 균일 A-값을 일으킬 수 있으며 따라서 기하학적 왜곡을 유도. 이러한 왜곡을 방지하기 위해 전체 표본을 통해 정확하고 통일 후 정렬 값 (A-값) 찾을 수 계산 방법 2를 적용 할 수 있습니다.

    1. 8 픽셀 높이 블록에 0에서 특정 신호의 예측 °와 180 °를 나누어 각 블록 사이의 X-축을 따라 이동합니다 (A-값) 계산하는 변형 이산 푸리에을 사용합니다.
    2. 표본의 길이를 따라 X 축 교대의 경사를 설명 각도 θ '을 계산하는 데 도움이, 그리고 회전 중심점을 찾기 위해 선형 최소 제곱 회귀을 적용합니다.
    3. 모든 proje을 돌려 스캔하는 동안 misalignments에 대한 수정회전 중심점 주변의 ctions θ '/ 2.

    2.2 대비 제한된 적응 히스토그램 균등화 (CLAHE)

    재건 및 / 또는 정량 평가에 대한 세분화하는 동안 "아웃 thresholded"할 위험이 아주 약한 신호를 전시 개체 (섬)의 탐지 및 세분화를 촉진하기 위해, CLAHE 알고리즘은 투영 이미지에 적용 할 수 있습니다. CLAHE 작업은 크게 두 강도 변환을 수행 :

    1. 지역 대비는 추정하고 투영 이미지의 겹치지 않는 블록 내에 관측소입니다.
    2. 농도는 다음 쌍 선형 보간을 통해 블록 사이의 국경 지역에서 표준화되어 있습니다.

    이름 대비 - 제한은 이미지에 포화 픽셀을 방지하도록 설정되어 클립 한도를 의미합니다. 이 프로토콜에서 MATLAB은 내장 기능 "adapthisteq은"기본 C와 함께 사용하고 적용 0.01의 입술 제한 및 256의 타일 크기입니다. 참고 최적의 타일 크기는 경험적으로 테스트하고 분석 표본에 따라 달라질 수 있어야합니다. 알고리즘 및 예제에 대한 자세한 내용은 Hörnblad 3에서 찾을 수 있습니다.

    참고! 위에서 열거 한 연산 처리 단계 표준 알고리즘을 기반으로하고 MATLAB (Mathworks)에서 실행됩니다 (COM-AR, A-값 조정 및 CLAHE 포함이 1.3-2.2 참조).

    2.3 단층 재건 및 ISO 표면 렌더링

    1. 필터링 백 프로젝션 알고리즘 사용하여 해결하고 표준화 된 이미지가 통일 misalignment 보상 및 동적 범위의 최적화를위한 최소한의 요건을 복원 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 모든 reconstructions는 NRecon 소프트웨어 (Skyscan), 버전 1.6.8 (에서 사용할 수있는 필터링 다시 투영 방법을 사용하여 수행됩니다= "_blank"> http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). 병렬 빔 형상은 이미지 설정에서 구현되지 않는 참고 이미징 객체의 배율은 렌즈의 초점에서의 거리에 따라 달라집니다. 따라서 NRecon 소프트웨어에 투영 데이터 세트를 가져올 때 그것은 첨부에 소스 거리 (mm) 및 스캐너의 회전 방향 (반대 방향 입력 "참조"및 방향 입력 "CW"에 대한)에 올바른 개체를 포함하는 것이 중요합니다 재건하는 동안 콘 빔 유도 유물을 피하기 위해, 파일을 기록합니다.
    2. 획득 가상 섹션의 스택을 시각화하고 정량화하기 위해 Imaris 또는 Volocity 등 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 3D ISO-표면을 생성합니다.

    손쥐 작은 섬 절연 및 이식 절차를 검토 프로토콜 아래의 당뇨병 연구소의 잠복기 세포 처리 및 병진 모델 코어에​​서 수행하고 Miam 대학에 의해 승인되었습니다전 기관 동물 케어 및 사용위원회. 동물 연구 윤리위원회, 북부 스웨덴, 동물을 포함한 다른 모든 실험을 승인했습니다.

    Representative Results

    현재 보고서에서 우리는 추출 및 NIR-OPT (그림 1)를 사용하여 쥐 pancreata의 BCM 데이터 (및 기타 조직)의 전산 처리를위한 프로토콜을 설명합니다. 그림 2에 도시 된 바와 같이, 췌장 표본에서 조직 autofluorescense대로 현저하게 NIR 스펙트럼에 감소 것으로 예상된다. Langerhans의 인슐린이라는 섬의 평가에 대한 비율 :이 소음에 대한 평균 신호 크게 증가 (N S)로 연결됩니다. 본 문서에 설명 된 스펙트럼의 NIR 부분의 이미지에 OPT의 적응으로 적어도 세 특정 채널이 충분한 S와 시각화 할 수 있습니다 : N 비율 뚜렷한와 손쥐 췌장의 볼륨을 통해 항체이라는 세포 유형의 평가를 사용하도록 설정 채널 분리 (그림 3과 4 참조). diabetogenic 프로세스 및 / 또는 일반적으로 BCM 평가 이미징에 적용, 기술은 따라서의 시각화 및 정량화이 가능주변 및 / 또는 세포 유형을 (그림 4 참조) 상호 작용에 관련된 인슐린 긍정적 인 부분입니다. 이러한 평가는 마우스 대응 (그림 5 참조)보다 3-5 배 큰 쥐 췌장 등의 이전보다 훨씬 더 큰 표본에 수행 할 수 NIR 범위에서 얻어진 증가 조직 침투 깊이 덕분에 있습니다. 에 관계없이 표시 또는 NIR 파장이 활용 여부, CLAHE의 구현은 크게 기술의 검출 감도 (그림 6 참조)를 증가시켜 다른 기원의 및 생리적 조건 중 BCM의 기반 평가를 선택 촉진 할 수 있습니다. 개발 된 샘플 홀더에 대한 청사진은 그림 7에 표시됩니다.

    그림 1
    1 그림. 흐름도는 mur의 BCM의 OPT 기반 분석을위한 중요한 단계를 묘사오프라인 췌장. 일반적인 마우스의 췌장을 평가하는 데 필요한 시간은 13~14일입니다. 스캔의 길이가 필요한 노출 시간 (일반적으로 약 1 시간)에 의존하는 반면 대부분의 시간은 조직 처리 및 immunohistochemical 얼룩 (10 일) 동안 소비되고, 조직 개간은 약 이일이 필요합니다. 이후 계산 처리는 일반적으로 하루 이내에 수행됩니다. 참고 상대적으로 긴 얼룩 프로토콜은 이상적 표본의 큰 양의 일괄 처리에 적합합니다.

    그림 2
    그림 2. 다른 파장의 BCM 평가에 대한 잡음 비율로 신호. 인슐린와 fluorochrome - 복합 이차 항체의 칵테일 (알렉사 488, 594, 680 및 물들 마우스 십이지장 췌장 기억 상실증에 걸린,다른 파장의 N 비율 : 750), S를 결정하는 데 사용되었다. A, 이미지는 각 신호 채널에 대한 첫 번째 투영 프레임을 보여줍니다. 각 신호 채널 N : 평균 S를 설명하는 B, 그래프. 비율은 배경 강도 (exocrine 세포의 내생 조직 형광)로 나누어 평균 작은 섬 강도 (215 섬에 따라)으로 결정됩니다. C, S를 표시 그래프 : N 알렉사 594 채널 획득 : S로 표준화 각 채널의 개별 섬에 대한 N 비율. 방법 중 하나 ANOVA는 통계 분석에 사용되었다. 유의 수준은 ** P <0.01에 해당하는 지적했다. (A) 1mm에 해당하는의 스케일 바는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

    그림 3
    그림3. 채널 분리는.이 표에 나와있는 Alexafluor 염료와 복합 차 항체는 proteinG - 세 파로스 구슬에 별도로 고정되었다. B, 형광 구슬 그런 다음 아가로 오스 팬텀의 여러 영역에서 임베디드 및 지정된 필터를 사용하여 이미지로 하였다.

    그림 4
    4 그림. 당뇨병 연구에 기반 다중 채널 이미지를 선택합니다. A, OPT는 비 비만 당뇨병 (NOD) 제 1 형 당뇨병에 대한 모델에서 췌장 (12 주, 십이지장 엽)의 ISO-표면 재건을 기반으로. 평활근 α-고를 (혈관, 붉은 색)과 3 번 CD (T-림프구에 침투, 녹색), 표본은 인슐린 (췌장 β-세포, 의사 색 파란색)에 얼룩이 있습니다. 사용하는 해당 보조 항체였다, Cy3, IRDye-680 각각 DyeLight-750.insets (는 A'-A '' ') 각각의 신호 채널을 보여줍니다. B, syngenic 섬과 이식 및 사후 이식 NIR-OPT 이주와 이미징 마우스 간 엽 (lobus 불길한 lateralis)의 OPT 이미지 (보기 날려). 인슐린 표현 섬은 파란색으로 pseuodocolored과 평활근 α-고를 긍정적 인 선박이 빨간색으로 있습니다. 방법은 혈관 네트워크에서 작은 섬 이식 분포 평가를 할 수 있습니다. 스케일 바 1mm에 해당합니다.

    그림 5
    그림 5. NIR-OPT 더 큰 표본의 이미지를 용이하게한다. 2 형 당뇨병 (9 개월 지라 엽)의 주커 지방산 모델에서 쥐 췌장에있는 BCM 배포판의 A, ISO-표면 렌더링, 쥐에서 이미지 표본에 가능성을 exemplifying NIR-OPT로 췌장 규모. 으로 결정이 기법에 의해 표시 엽은 마우스 대응보다 (V / V) ~ 6 배 큰이며, β-세포 볼륨 전체 소엽 볼륨의 1.32 %를 구성하는 Langerhans의 섬을 표현 10,139 인슐린을 비호. B, (A) 조직의 깊이에서 섬이 감지되는 도시의 깨진 라인에 해당하는 단층 절을 참조하십시오. C, 크기 참조로 표시 마우스 췌장 (8 주에서 지라 엽)에 BCM 배포판의 ISO-표면 렌더링. 표시 엽 누구의 β-세포 볼륨 전체 소엽 볼륨의 0.89 %를 구성하는 2,490 인슐린 표현 섬을 비호. pancreata는 Alexa594 복합 염소 안티 - GP (마우스) 각각 IRDye 680 복합 돈키 안티 - GP (쥐) 항체 다음 GP 방지 인슐린 물들입니다. 의 표본이 (AC) (C) 2mm에 해당하는에 크기와 규모 막대로 그려져있다.

    그림 6 6 그림. CLAHE는 OPT 영상으로 손쥐 췌장에 섬의 확인을 용이하게한다. AC, C57Bl / 6 마우스 췌장 (8 주에서 지라 엽)의 대표 ISO-표면 렌더링 OPT 이미지가 인슐린에 대한 분류. OPT 이미지 ISO-표면 reconstructions는 이전에 수행 된 (A, 의사 색 녹색)과 CLAHE 프로토콜 후에 (B, 의사 붉은 색) 적용되었습니다. C,의 정규화되지 않은 데이터의 오버레이 (A)와 (B)에 CLAHE 처리 데이터입니다. C'-C 붉은는 "섬", (A) 정규화되지 않은 및 CLAHE 가공 (B) 이미지의 대표 높은 배율 오버레이.으로의 존재에 의해 표시 "CLAHE 스크립트가 작고 낮은 신호의 검출을 용이하게 강도 섬이 있습니다. 현재의 예에서 설명 된 표본은 (CLAHE 처리 이후) 해당 처리되지 않은 프로젝션 데이터를 기준으로 숫자가 1,057 섬 부이었다 1.74 mm 3 (의 볼륨과 2419 섬을 숨겨1.77 mm 3)의 볼륨 일. D와 E, 제어 (D)와 CLAHE 프로토콜을 구현 6개월에서 2 형 당뇨병 12 (E)의 OB / OB 마우스 모델에서 예 데이터입니다. OB / OB 췌장 (E)의 작은 섬 크기의 대규모 일반 증가합니다. 의 (D)와 (E) 췌장의 개요 (회색)은 조직 autofluorescence에서 신호를 기준으로합니다. C의 스케일 바는 AC 500 μm이다. C의 스케일 바는 "C '와 C'. 스케일 바 E에가 1mm에 해당하는에 200 μm를 해당 (D)와 (AC) Hörnblad 3에서 적응에 (E). 이미지와를 사용하여 생성 된 Bioptonics 3001 스캐너.

    그림 7
    그림 7. OPT의 표본의 첨부 파일 샘플 홀더는. 표본은 플랜지의 사전 교련 구멍을 통해 아가로 오스 스페이서를 통해 바늘을 삽입하여 고정된다. 홀더는를 통해 스테퍼 모터에 힌지입니다강력한 자석은 기지에 위치하고 있습니다. 이 설정은 불안정 접착제의 사용을 생략하고 스캔하는 동안 표본의 원치 않는 움직임을 방지 할 수 있습니다.

    Discussion

    OPT 이미지에 대한 설명 기술 손쥐 췌장의 볼륨을 통해 공간 및 정량 매개 변수 추출 할 수 있습니다. mesoscopic 이미지 그것의 유형에 달성 해상도의 제한으로 인해 주목해야한다, 대부분의 이미징 modalities뿐, 큰 표본 낮은 해상도 (높은 해상도 CCD의 사용 OPT 스캔의 해상도를 증가해야하지만) . 따라서, 손상 췌장 마우스 엽의 평가에 대해, 현재의 기술은 비록 가까이 (약 15-20 μm) 7 단세포 해상도를 제공하지 않습니다. 하지만, 마우스 췌장에서 BCM 분포의 추출을위한 프로토콜은 잘 morphometry 3,13를 계산 예를 들어 포인트 획득 일치 이상 이것은 주목해야하는 데이터를 제공 한 CLAHE 프로토콜의 구현은 훨씬 더 많은 섬의 검출이 가능하지만, 이 섬은 일반적으로 작은 및 contribu하지테는 실질적으로 전체 β-세포 볼륨합니다.

    참여 immunohistochemical 프로토콜 (최대 2 주) 비교적 긴하지만, 표본 준비 시간에 실제 손은 짧고 따라서 기술이 잘 동물 9 큰 무리들이 연구에 적합이다. heterogenic 유통 패턴의 가능성이 조사를 위해 초점을 경우, 그 치료는 고정에 관한 및 췌장 조직이 불리한 방식으로 고정되고, 평면 ( "분산"라고 방지하기 위해 설치 단계에서 촬영해야한다고 강조한다 조직의) 마운트는 이러한 평가를 용이하게 할 수 있도록 노력하여야한다.

    OPT를 수행 중요한 문제는 샘플의 COM은 회전 축에 고정하고 스캐닝 절차를 수행하는 동안, 각 수직 또는 수평으로 움직이지 않는 점이다. 따라서이 attachi을위한 안정적인 기계 설치 및 잘 작동 시스템을 가지고 필수적입니다NG 샘플. 우리는 새로운 마운트 (그림 7)를 구성하여이 문제를 해결.

    병렬 구조는 우리 NIR-OPT 또는 뒷면과 기록 투영 이미지의 주변 물체의 앞에 위치 사이의 수직 변화로 감지되었습니다 Bioptonics 3001 스캐너에 대해 사실이 아닌. (2.3.1 참조) 각 스캐너의 로그 파일에 소스 거리에 객체를 조정함으로써 우리는 크게 우리의 데이터의 품질을 향상시킬 수 있으며 특히 중요하다 투영 이미지의 맨 가장자리에 기하학적 왜곡에 대한 수정하면 큰 표본을 평가.

    현재 프로토콜에서 우리는 세 가지 특정 채널과 그대로 췌장 준비를 평가에 "해부학"채널의 시각화를 허용 필터 세트의 제안을 제공합니다. 분명히 이러한 설정은 fluores 모든 형태의과 마찬가지로 더 나은 비록 주어진 연구에 활용 fluorochromes에 맞게 조절 될 수센트 현미경은 신호 블리드 - 스루의 가능성 위험을주의 깊게 평가해야합니다. 750 나노 미터보다 기쁘게 생각합니다 fluorochromes과 인슐린이라는 섬의 연구는 아직 우리의 세트가 활용되는 금속 할로겐화물 램프를 사용하여 당사 수 없었습니다. 그것은 다른 광원 (예 : 다이오드 레이저)와 함께 해당 파장에서 더 높은 양자 효율 카메라가 더 NIR-OPT의 가능성을 높이고 더 높은 파장에서 이미징 할 수 있도록 수 수 있습니다.

    OPT 영상은 mm-cm 규모의 생물 의학 표본의 공간 및 정량 평가를위한 매우 다양한 기술입니다. 여기에 제시된 프로토콜 췌장 / 당뇨병 연구의 주요 목적으로 개발되었습니다 있지만 그들은 다른 종, 표본 유형 및 마커에 대한 연구로 번역 할 수 있어야한다. NIR-OPT 이미지 F, 그대로 췌장 준비에서 여러 별개의 채널을 시각화 할 수있는 가능성으로urther은 오래 대비 에이전트도 OPT에 의해 감지 형광를 운반하도록 설계 할 수 다른 이미징 modalities에 의해 비 침습적 평가를위한 대비 요원의 이해 특이성을 평가하는 도구로 잠재력을 보유하고 있습니다.

    Disclosures

    관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

    Acknowledgements

    박사 P.의 Lindström는 OB / OB 쥐를 제공하기 위해 인정하고 있습니다. J. Lehtonen는 편집에 도움 비디오 제작 및 J. 길버트와 도움을 인정합니다. (JS와 :이 연구는 당뇨병 연구소 재단 (AP), 아동 당뇨병 연구 재단 (AP 및 UA), 유럽위원회 (European Commission) (. CP-IP 228933-2 FP-7, 아니 부여 계약)의 보조금에 의해 지원되었다 UA), Kempe 재단, Umeå 대학과 UA로 스웨덴 연구 협의회

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Methanol Scharlau ME03162500
    30% H2O2 Scharlau HI01362500
    Benzyl Alcohol Scharlau AL01611000
    Benzyl Benzoate Scharlau BE01851000
    Low-meltingpoint agarose LONZA 50100
    Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
    DMSO Sigma-Aldrich D5879
    Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787
    Mouse anti-aSMA-Cy3 Sigma-Aldrich C6198 Primary antibody
    Rabbit anti-CD3 Sigma-Aldrich C7930 Primary antibody
    Guinea Pig anti-Ins DAKO A0564 Primary antibody
    Donkey anti GP-IRDye680 LI-COR Biosciences 926-32421 Secondary antibody
    Goat anti Rb-DyeLight750 Thermo Scientific 35570 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa594 Molecular Probes A-11076 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa488 Molecular Probes A-11008 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa594 Molecular Probes A-11012 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa680 Molecular Probes A-21076 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa750 Molecular Probes A-21039 Secondary antibody
    OPT Skyscan 3001 Bioptonics OPT-Scanner
    Leica MZ FLIII Leica Microsystems Stereomicroscope
    Leica Objective 0.5x Leica Microsystems 10446157
    Leica Camera adapter 1.0x Leica Microsystems 10445930
    EL6000 Metal Halide 11504115 Lightsource
    Liquid Light Guide 11504116
    Cuvette Hellma Analytics 6030-OG 55 x 55 x 52.5 mm
    Mirror Edmund Optics F68-334 50 x 50 mm
    Andor Ikon-M Andor Technology DU934N-BV Back-illuminated CCD
    Filterset Chroma Technology 41021-MZFLIII TXR, Alexa-594, Cy3
    Filterset Chroma Technology 41022-MZFLIII IRDye680, Alexa-680
    Filterset Chroma Technology 49037-MZFLIII Dylight750, Alexa-750
    ProteinG-Sepharose beads GE Healthcare 17-0618-01 Protein G Sepharose 4 Fast Flow
    Sodium Azide Sigma-Aldrich 08591 Sodium azide 0.1 M solution

    References

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    Comments

    1 Comment

    Very interesting. this is not my field of study but I believe that your work is very important and it blows my mind. Christoffer Svensson, We know who has the BIG brains in the family. Congratulations on all your success and hard work I am proud of you. One day you have to take a couple of hours and sit down and explain it to me.
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    Posted by: Alexander S.January 15, 2013, 1:07 AM

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