JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Russian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Clinical and Translational Medicine

Рядом с инфракрасной оптической томографии проекции для Оценки β-клетки массового распространения в исследованиях диабета

*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 4, 1, 1

1Umeå Centre for Molecular Medicine, Umeå University, 2Cell Transplant Center, Diabetes Research Institute, University of Miami,, 3EMBL-CRG Systems Biology Program, Centre for Genomic Regulation, Catalan Institute of Research and Advanced Studies, 4Dept. of Computing Science, Umeå University

* These authors contributed equally
Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Мы описываем адаптации оптической томографии проекции (OPT)

    Date Published: 1/12/2013, Issue 71; doi: 10.3791/50238

    Cite this Article

    Eriksson, A. U., Svensson, C., Hörnblad, A., Cheddad, A., Kostromina, E., Eriksson, M., et al. Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research. J. Vis. Exp. (71), e50238, doi:10.3791/50238 (2013).

    Abstract

    По адаптации OPT, чтобы включить возможность обработки изображений в ближней инфракрасной (ИК) спектра, то здесь, иллюстрируют возможность изображение более крупные тела ткани поджелудочной железы, такие, как крысы поджелудочной железы, а также увеличить количество каналов (типы клеток), которые могут быть изучены в единственном экземпляре. Мы также описывают реализацию ряда вычислительных средств, которые обеспечивают: 1 / точное позиционирование (в нашем случае поджелудочная железа) образца центра масс (COM) на оси вращения (AR) 2, 2 / улучшенные алгоритмы сообщение выравнивание настройка, которая предотвращает геометрических искажений во время томографической реконструкции 2 и 3 / протокол для выравнивания интенсивности увеличить сигнал шум в OPT-BCM на основе определения 3. Кроме того, мы описываем держатель образца, что сводит к минимуму риск непреднамеренного перемещения образца в процессе получения изображения. Вместе взятые, эти протоколы позволяют оценкам BCM распределения и др.э возможности, должны быть выполнены во всем объеме нетронутыми pancreata или других органов (например, в исследованиях трансплантации островков), с разрешением вплоть до уровня отдельных островков Лангерганса.

    Introduction

    Продуцирующих инсулин β-клетки играют ключевую роль в способности организма контролировать гомеостаз глюкозы в крови. Таким образом, оценка распределения BCM поджелудочной железы крайне важны для многих областей доклинических исследований диабета. В оценке терапевтических режимов, например, влияние целевых генов абляции на эндокринную дифференцировки клеток или исследования диабета этиологии у грызунов моделей для болезни часто зависит от таких анализов. Традиционно, эти виды оценок полагались на времени стереологического подходы, которые трудно выполнить из-за размера и сложного анатомического строения поджелудочной железы. Самое высокое разрешение изображений подходов в настоящее время (обычно оптический), не обеспечивают достаточную глубину проникновения, чтобы все визуализации поджелудочной железы грызунов. И наоборот, изображения подходы, которые не ограничены их глубина проникновения (как правило, ядерные) предоставляют низкое разрешение разрешить полное распределение BCM и мешаетв связи с отсутствием адекватных контрастных агентов 4,5.

    Оптическая томография проекции 3D метода визуализации, который позволяет с высокой разрешающей оценки медико-биологических образцов на мм до см шкале 6. Настоящим информации о пространственном положении и объем отдельных инсулина выражения островков Лангерганса могут быть извлечены по всему объему поджелудочной железы в нормальных и диабетических мышей 3,7-10. Цель данного исследования заключается в дальнейшем укреплении потенциала этой техники для оценки поджелудочной железы β-клеток, их эндогенным распределения, когда привитые в других тканях, их связь с другими составляющими поджелудочной железы (например, проникновение типы клеток) и в большей препараты поджелудочной железы, чем это было возможно ранее.

    Ближней инфракрасной оптической томографии проекции (NIR-OPT) установки

    В приведенном ниже протоколы, OPT сканер на основе оригинальной настройке описывается Шарпу 1, адаптированные к визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне описаны и использованы. Для оценки одного канала поджелудочной железы мыши (например, BCM), SkyScan 3001 (Bioptonics) сканер может быть использован.

    Металлогалогенные лампы, что обеспечивает более высокую энергию возбуждения, чем дуговой ртутной лампы на длинах волн выше 650 нм, поставляет возбуждающего света. Свет передается через жидкие световод. Полезные сочетания флуорохромы и полосового фильтра для NIR флуоресценции и разделение каналов показано на рисунке 3. Излучаемого света обнаружен с задней подсветкой ПЗС-камеры, с высокой квантовой эффективностью в спектре НДК. OPT сканирования автоматизированы с помощью платформы LabView, который управляет камерой и шагового двигателя. Для поддержки образцы в размере нетронутыми pancreata крысы, защищенный покрытием из серебра зеркало и большой кювет используется. Наконец, держатель образца, который устраняет нежелательные вертикальные movemenTS образца во время сканирования была разработана.

    Protocol

    1. Подготовка проб и сканирование

    1,1 Пробоподготовка

    Следующая процедура выполняется по существу, как описано выше 7.

    1. Урожай поджелудочной железы. Используйте ледяной PBS, чтобы избежать протеолитической деградации.
    2. Закрепите ткань в 4% PFA в PBS на льду в течение 2-3 часов. Убедитесь, что лопасти «расползаются» во время фиксации. Это облегчит идентификацию анатомических ориентиров после реконструкции.
    3. Вымойте более PBS в течение 30 мин.
    4. Высушить поджелудочной железы поэтапно в метаноле (33, 66%, 100%), 15 мин / шаг. Это сводит к минимуму образование пузырьков во время отбеливания (см. шаг 5) и предотвращает разрушение клеток во время замораживания-оттаивания (см. пункт 7).
    5. Инкубируйте ткани в свежеприготовленный MeOH: H 2 O 2: ДМСО отбеливания буфером в соотношении 2:01:03 при комнатной температуре в течение 24 часов, чтобы утолить эндогенной флуоресценции ткани. Для более крупных образцов, обмен на новые bleachiнг буфера и инкубируют еще в течение 24 часов.
    6. Вымойте более MeOH, ON.
    7. Замораживания-оттаивания, по крайней мере, 5 циклов в -80 ° C - RT для облегчения проникновения антител.
    8. Увлажняет ступенчатой ​​обратно в TBST (33, 66%, 100%), 15 мин / шаг.
    9. Блок в TBST с 10% сыворотки (предпочтительно из того же вида, в котором вторичные антитела был создан), 5% DMSO и 0,01% Naaz в течение 12-24 часов при комнатной температуре
    10. Инкубируйте с первичными антителами в блокирующем буфере в течение 48 часов, при комнатной температуре, распространяется на 72 часа для больших образцов (антитела, используемые здесь, занесены в таблицу реагентов).
    11. Вымойте более TBST, ON.
    12. Инкубируйте с флуоресцентной сопряженных вторичными антителами в течение 48 часов, при комнатной температуре, распространяется на 72 часа для больших образцов.
    13. Вымойте более TBST, ON.

    1,2

    Следующая процедура описывает, как установить образец в агарозном и приложите его к заказу держатель образца (см. рисунок 7) До OPT сканирования.

    1. Отделить селезенки, желудка и двенадцатиперстной долями в соответствии с рис 3А в Hörnblad и др. 3. Отношения между лепестков дальнейшее уточнение в Hörnblad и др. 11.
    2. Подготовка 1,5% (вес / объем) низкой температурой плавления агарозы в дН 2 O, фильтр, дать остыть до 37 ° C и промойте ткань в дН 2 O, чтобы смыть моющее средство и удалите пузыри, прежде чем агароза-вложения на льду.
    3. Вырежьте блок агарозном ограждающих вашего образца и оставить ~ 1 см прокладки между образцом и базой агарозы. Обрежьте острыми краями (≤ 90 °) блока агарозы, чтобы уменьшить рассеяние света.
    4. Высушить образца поэтапно в MeOH (33, 66%, 100%), позволяющий своевременно равновесие между каждым шагом. Когда образец погружается он считается уравновешенным.
    5. Очистить образца в раствор 1:2, бензилового спирта: Benzyl Benzoate (Babb), пока она не станет прозрачной. Биржи Babb решения и инкубировать в течение дополнительных 12 часов.
    6. Установите очищенный образец в держателе образца и закрепите его, вставив 2 иглы через спейсер агарозы через отверстия во фланцах владельца.
    7. Поместите образец в сканер и погрузить его в кювету, заполненную раствором Babb очистки. При сравнении ряда pancreata же увеличении должен быть использован для всех сканов. Увеличение должно быть оптимизировано для крупных образцов в серии.

    1,3 позиционирования образца в AR

    Следующий протокол описывает процедуру для точного позиционирования образца с помощью COM-AR алгоритм. Эта процедура применяется только при ROI включает в себя весь образец. Более подробное описание алгоритмов, см. Cheddad и др. 2.

    1. Получение изображений образца в двух положениях для ботач анатомии и сигнальных каналов. Позиция 1 при 0 ° (связанные с X-ось), отображающий крупнейший область проекции, и положение 2 при 90 ° С (связанный с Z-оси). Мы используем канал GFP для визуализации анатомии.
    2. Применить ожидания максимизации (EM) алгоритм по анатомии изображений порог рентабельности.
    3. Рассчитать COM точек (х-координаты) бинарных изображений, полученных в шаге 2 для 0 ° и 90 ° прогнозы.
    4. Наложение вертикальной линии, проходящей через COM определены точки, рассчитанной на шаге 3 на 0 ° и 90 ° образы сигнала канала.
    5. Использование изображений, полученных на шаге 4 ссылки для перемещения образца таким образом, чтобы центральная линия поля зрения проходит через найдено COM точках образца.

    1,4 Сканирование

    1. Регулировка времени экспозиции для достижения высокого сигнала к шуму невозможна без насыщенияТина любой области проекции изображений. Повторите эти действия для всех каналов, которые будут проверяться.
    2. Выберите набор фильтров для первого канала флуоресценции для проверки. Выбросы от короткого флуорофоров λ могут возбуждать флуорофоры с более λ и тем самым вызвать фото отбеливания. Чтобы минимизировать эту возможность, сканирование флуорофора с длинным возбуждения λ в первую очередь.
    3. Открытие затвора для освещения образца и сбор сигнала флуоресценции на 360 °, поворот образца вдоль вертикальной оси для каждого канала. Шаг угла, используемый для NIR-OPT установки составляет 0,9 °, и для Bioptonics 3001 сканер 0,45 °.
    4. Выберите соответствующий фильтр на следующий канал и, как и выше.

    2. Вычислительная обработка и реконструкции

    2,1 после приобретения обнаружения смещения и коррекции (стоимость тюнинг)

    В проекции томография, это в целом необходимыназначить после выравнивания значения проекций для тонкой настройки изображения положении вдоль оси вращения до реконструкции. Тем не менее, небольшое отклонение от нормы в угол камеры по отношению к оптической оси может привести к неоднородным значения по длине образца и таким образом вызывают геометрические искажения. Чтобы избежать таких искажений, вычислительный метод, чтобы найти точную и единую после согласования стоимости (стоимости) на протяжении всего образца могут быть применены 2.

    1. С помощью дискретного преобразования Фурье для разделения проекции определенный сигнал при 0 ° и 180 ° на 8 блоков пикселей по высоте и рассчитать сдвиг вдоль оси х (значение) между каждым блоком.
    2. Применение линейной регрессии наименьших квадратов, чтобы вычислить угол θ ', который описывает наклон оси х смен по длине образца, и найти вращательные центральной точки.
    3. Исправьте для смещения во время сканирования, вращая все проеctions θ / 2 вокруг точки вращательным центра.

    2,2 контрастности ограниченной адаптивной эквализации гистограммы (CLAHE)

    Для облегчения обнаружения и сегментации объектов (островки) экспонирование очень слабые сигналы, которые подвергаются риску быть "thresholded из" во время реконструкции и / или сегментации для количественных оценок, CLAHE алгоритм может быть применен к проекции изображений. Операция CLAHE осуществляется с двух крупных преобразований интенсивности:

    1. Локальный контраст оценивается и сравнял счет в непересекающихся блоков в проекции изображения.
    2. Интенсивность затем нормированы в приграничных регионах между блоками через билинейной интерполяции.

    Название отличие ограниченной относится к темам предела, который установлен, чтобы избежать насыщения пикселей в изображении. В этом протоколе MATLAB встроенной функции "adapthisteq" был использован и применяется по умолчанию C губы предел 0,01 и плитка размером 256. Отметим, что оптимальный размер плитки должна быть проверена эмпирически и могут варьироваться в зависимости от образца проанализированы. Подробнее об алгоритме и примеры можно найти в Hörnblad и др. 3.

    Внимание! Перечисленных вычислительных этапов обработки (в том числе COM-AR, A-Цена тюнинга и CLAHE см. 1.3-2.2) построены на стандартных алгоритмах и выполнены в MATLAB (Mathworks).

    2,3 томографической реконструкции и изо-поверхность рендеринга

    1. Использование фильтром обратного проецирования алгоритм, исправленное и нормализованных изображений теперь может быть восстановлен с единой компенсации смещения и минимальные требования для оптимизации динамического диапазона. В этом протоколе все реконструкций проводятся с использованием фильтрованной методом обратной проекции доступны в NRecon программного обеспечения (SkyScan), версия 1.6.8 (= "_blank"> Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Отметим, что увеличение отображаемого объекта зависит от его расстояния от точки фокуса объектива, если параллельной геометрии пучка осуществляется в визуализации установки. Таким образом, при импорте проекции набора данных в программное обеспечение NRecon важно включить нужный объект на источник расстояние (мм) и направление вращения сканера (против часовой стрелки для входа "CC" и для правого входа "CW") в сопроводительной лог-файл, чтобы избежать конуса пучка индуцированных артефакты во время реконструкции.
    2. Чтобы визуализировать и количественно стеке виртуальных разделов получено, создания 3D-изо-поверхностей с использованием соответствующего программного обеспечения для обработки изображений, такие как Imaris или Volocity.

    Мышиные изоляции островок и трансплантации процедуры были выполнены в доклинических сотовых диабета научно-исследовательский институт по переработке и трансляционных базовой модели по протоколам рассмотрены и одобрены Университета MiamЯ Институциональные уходу и использованию животных комитета. Этический комитет для исследований на животных, северная Швеция, одобрили все другие эксперименты с участием животных.

    Representative Results

    В настоящем докладе мы опишем протокол по добыче и вычислительной обработки данных в BCM грызунов pancreata (и других тканей) с помощью NIR-OPT (рис. 1). Как показано на рисунке 2, ткань поджелудочной железы autofluorescense от образца, как и ожидалось заметно снизилась в спектре НДК. Это приводит к значительному увеличению среднего сигнала к шуму (S: N) соотношение для оценки инсулина помечены островков Лангерганса. По адаптация решили изображений в части NIR спектра, как описано здесь, по крайней мере, три конкретные каналы могут быть визуализированы с достаточным S: N отношение включить оценку антитела, меченного типов клеток по всему объему мышиной поджелудочной железы с четкими разделение каналов (см. рисунок 3 и 4). Применительно к визуализации процессов сахарного диабета и / или BCM оценки в целом, таким образом, позволяет технику для визуализации и количественной оценкиинсулина положительной области по отношению к окружающим и / или взаимодействующих типов клеток (см. рисунок 4). Такие оценки благодаря увеличению глубины проникновения в ткани, полученные в диапазоне NIR можно выполнять в гораздо более крупные экземпляры, чем ранее, в том числе поджелудочной железы крыс, которые в 3-5 раза больше, чем его коллега мыши (см. Рисунок 5). Независимо от того, видимой или ближней ИК волн используются, реализация CLAHE может значительно облегчить OPT на основе оценки BCM во время различных генетических и физиологических условий путем повышения чувствительности обнаружения техники (см. Рисунок 6). Основой для развитых держатель образца показано на рисунке 7.

    Рисунок 1
    Рисунок 1. Блок-схема изображающие важные шаги для OPT основе анализа BCM в мурнеравенства поджелудочной железы. Время, необходимое для оценки типичного поджелудочной железы мыши составляет 13-14 дней. Большую часть времени расходуется в процессе обработки ткани и иммуногистохимического окрашивания (10 дней), ткань очистки требуется около 2 дней, тогда как длина сканирования зависит от времени экспозиции требуется (обычно около 1 часа). Последующие вычислительной обработки обычно осуществляется в течение дня. Отметим, что относительно длительного окрашивания протокол идеально подходит для пакетной обработки большого количества образцов.

    Рисунок 2
    Рисунок 2. Сигнал к шуму для BCM оценок на различных длинах волн. Мышью двенадцатиперстной доли поджелудочной железы, окрашенных в инсулине и с коктейлем из флуорохромом сопряженных вторичными антителами (488 Alexa, 594, 680 и750), был использован для определения S: N соотношения на разных длинах волн. , Изображения показывает первый кадр проекции для каждого канала. B, график, иллюстрирующий среднем S: N для каждого канала. Отношения были определены как средняя интенсивность островке (на основе 215 островков), деленная на интенсивность фона (эндогенная флуоресценция тканей из экзокринной ткани). C, График, показывающий S: N коэффициентов для отдельных островков в каждом канале, нормированный на S: N, полученные для Alexa 594 каналов. Один из способов ANOVA была использована для статистического анализа. Значение уровня, указанного соответствуют ** р <0,01. Шкала бар (А) соответствует 1 мм. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

    Рисунок 3
    Рисунок3. Разделение каналов., Вторичные антитела, конъюгированные с красителями Alexafluor, перечисленных в таблице были обездвижены отдельно на proteinG-сефарозе бисера. B, флуоресцентные шарики, то встроенные в разные уровни в агарозном призрак и отображаемого использованием указанных фильтров.

    Рисунок 4
    Рисунок 4. OPT на основе многоканальных изображений при сахарном диабете исследования., OPT основе ISO-реконструкция поверхности поджелудочной железы (12 недель, двенадцатиперстной доли) от не Тучные Диабетическая (NOD) модели для диабета 1 типа. Образца окрашивали для инсулина (островок β-клеток, псевдо-синего цвета); гладких мышц α-актин (кровеносные сосуды, красный) и CD3 (проникновение Т-лимфоцитов, зеленый). Соответствующие вторичные антитела были использованы; Cy3, IRDye-680 и DyeLight-750 соответственно.вставками (A'-'' ') показать отдельные каналы сигнала. B, OPT изображения (раздутие зрения) доли печени мыши (lobus зловещие латеральной) привиты с сингенными островков и полученную с использованием NIR-OPT две недели после трансплантации. Инсулина, выразив островки pseuodocolored в синих и гладких мышц α-актина положительные судов в красный цвет. Такой подход позволяет оценки островок трансплантата распределение в сосудистой сети. Шкала баров соответствует 1 мм.

    Рисунок 5
    Рисунок 5. NIR-OPT облегчает визуализацию больших образцов., Iso-поверхность оказания BCM распределения в поджелудочной железе крыс Zucker с жирной моделью для сахарного диабета 2 типа (селезенки долей в 9 месяцев), иллюстрирующих возможности изображения образца на крыс Поджелудочная железа масштабе NIR-OPT. Как определяетсяс помощью этого метода отображается доля составляет ~ 6 раз больше (V / V), чем его коллега мышью и гаваней 10139 инсулина выражения островков Лангерганса которых β-клетки объем составляет 1,32% от общего объема лобулярной. B, Томографик секции, соответствующей ломаная линия (А), показывающий, что островки из всех глубинах тканей не обнаружено. C, Iso-поверхность оказания BCM распределения мыши поджелудочной железы (селезенки доли в 8 недель) отображается в виде ссылки размера. Отображаться доли таит в 2490 инсулина выражения островки которого β-клетки объем составляет 0,89% от общего объема лобулярной. Pancreata окрашивают GP анти-инсулина следует Alexa594 сопряженных козьего анти-GP (мыши) и IRDye 680 Сопряженные Donkey анти-GP (крыса) антител, соответственно. Образцов (AC) изображены в масштабе и масштабе бар в (C) соответствует 2 мм.

    Рисунок 6 Рисунок 6. CLAHE облегчает обнаружение островков в мышиной поджелудочной железы изображений ОПТ. Переменного тока, представитель изоповерхности оказанных OPT изображений C57Bl / 6 мышей поджелудочной железы (селезенки доли в 8 недель), предназначенного для инсулина. Iso-поверхность реконструкции OPT изображения были выполнены до (псевдо окрашены в зеленый цвет) и после того, как протокол был применен CLAHE (B, псевдо-красного цвета). С Наложение ненормированного данные в (А) и CLAHE обработанные данные в (B). С ^-С ", представитель высокой наложения увеличение ненормированного (А) и CLAHE обработанные (B) изображений. Как показали наличие" красных лишь "островки, CLAHE скрипт облегчает обнаружение малых и низкий уровень сигнала Интенсивность островки. В данном примере изображен образца (после CLAHE обработки) питал 2419 островков с объемом 1,74 мм 3 (номера на основе соответствующих необработанные данные проекции был 1057 островков Wiго объема 1,77 мм 3). D и E, пример данных управления (D) и OB / OB модель мыши для сахарного диабета 2 типа 12 (E) в течение 6 месяцев реализации CLAHE протокол. Обратите внимание на массивные общее увеличение островок размером в OB / OB поджелудочной железы (E). В (D) и (E) поджелудочной железы контур (серый) на основе сигнала от тканей автофлуоресценции. Шкала бар в C составляет 500 мкм переменного тока. Шкала бар в C "соответствует 200 мкм в C и C''. Шкала бар в E соответствует 1 мм (D) и (E). Изображения в (AC) взяты из Hörnblad и др. 3 и были получены с использованием Bioptonics 3001 сканер.

    Рисунок 7
    Рисунок 7. Держатель образца для крепления OPT образцов. Образца обеспечивается путем введения иглы через спейсер агарозы через предварительно просверленные отверстия во фланцах. Держатель крепится на петлях, шагового двигателя с помощьюСильный магнит находится в его основание. Эта установка не включает использование неустойчивых клеи и предотвращает нежелательные перемещения образца во время сканирования.

    Discussion

    Описанные методы OPT изображений позволяет добыче пространственных и количественных параметров по всему объему мышиной поджелудочной железы. Из-за ограничений в достижимое разрешение для этого типа мезоскопических изображений следует отметить, что, как и для большинства методов визуализации, тем больше образцов, тем ниже разрешение (Хотя использование более высокого разрешения CCD должны увеличивать разрешение сканирования OPT) . Таким образом, для оценки доли нетронутыми мыши поджелудочной железы, техника в настоящее время не обеспечивает единую резолюцию клетки, хотя близко (приблизительно 15-20 мкм) 7. Тем не менее, для извлечения BCM распределения в поджелудочной железе мыши протоколы были получены данные, что более чем хорошо совпадают получены, например, подсчет числа точек морфометрии 3,13 Следует отметить, что, хотя реализация протокола CLAHE позволяет для обнаружения значительно больше островков , эти островки, как правило, меньше и не вкладаТе существенный вклад в общий β-клетки томах.

    Иммуногистохимического протоколов участвует сравнительно длительные (до двух недель), но фактическое рук на время подготовки образца короткая и поэтому этот метод хорошо подходит для изучения больших когорт животных 9. Если потенциал гетерогенные модели распределения внимания для исследования, следует подчеркнуть, что следует проявлять осторожность в отношении шагов фиксации и монтажа, чтобы избежать этого ткани поджелудочной железы становится зафиксирован в неблагоприятных пути и плоские («расползаются» ) крепления ткани следует стремиться содействовать таких оценок.

    Важным вопросом при проведении ОПТ является то, что COM образца устанавливается на оси вращения, и что он не двигается, либо вертикально, либо горизонтально, во время процедуры сканирования. Поэтому очень важно иметь стабильные механические установки и хорошо функционирующая система attachiнг образца. Мы решили эту проблему путем строительства нового крепления (рис. 7).

    Параллельно геометрия была не относится к нашему NIR-OPT или Bioptonics 3001 сканер, который был обнаружен в виде вертикального сдвига между задней и передней позиции периферических объектов в проекции изображений, записанных. Регулируя объект источника расстоянии в лог-файл соответствующего сканера (см. 2.3.1) мы могли бы значительно улучшить качество наших данных и коррекции геометрических искажений на дальнем краю проекции изображения, что особенно важно при оценки более крупные экземпляры.

    В текущем протоколе, мы предоставляем предложение наборы фильтров, которые позволяют визуализации трех различных конкретных каналов и «анатомии» канала в оценках нетронутыми препараты поджелудочной железы. Очевидно, что эти параметры могут быть модулированной, чтобы лучше соответствовать флуорохромы использованы для данного исследования, хотя, как и во всех формах флуоресценциипроцентов микроскопии, потенциальной опасности сигнал проступание должны быть тщательно проанализированы. Исследование инсулина помечены островки флуорохромами, которые возбуждаются выше 750 нм до сих пор не удалось нами по металлогалогенные лампы, что наши настройки используются. Вполне возможно, что камеры с еще более высокой квантовой эффективностью в соответствующих длин волн в сочетании с альтернативными источниками света (например, диодные лазеры) может увеличить потенциал NIR-OPT дальше и позволить для работы с изображениями при еще более высоких волнах.

    OPT изображений является весьма универсальный метод для пространственные и количественные оценки биомедицинских образца на мм-см масштабе. Хотя протоколы, представленные здесь, были разработаны для основных целей поджелудочной железы / диабете исследований они должны быть возможно перевести на исследования других видов, типов и образцов маркеров. По потенциал, чтобы визуализировать несколько отдельных каналов в неповрежденном препараты поджелудочной железы, NIR-OPT изображений Further имеет потенциал в качестве инструмента для оценки поглощения специфика контрастных агентов предназначен для неинвазивной оценки других методов визуализации тех пор, пока эти контрастные вещества могут быть предназначены для перевозки и флуорофор обнаруживается ОПТ.

    Disclosures

    Нет конфликта интересов объявлены.

    Acknowledgements

    Д-р П. Линдстрем признано за предоставление OB / OB мышей. J. Лехтонен признан за помощь в производстве видео и J. Gilbert за помощь в редактировании. Это исследование было поддержано грантами от диабета научно-исследовательского института Foundation (AP), детского диабета исследовательский фонд (AP и UA), Европейская комиссия (FP-7, Грант соглашения нет. CP-IP 228933-2) (JS и UA), Кемпе фонды, Умео университета и Шведского исследовательского совета в UA

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Methanol Scharlau ME03162500
    30% H2O2 Scharlau HI01362500
    Benzyl Alcohol Scharlau AL01611000
    Benzyl Benzoate Scharlau BE01851000
    Low-meltingpoint agarose LONZA 50100
    Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
    DMSO Sigma-Aldrich D5879
    Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787
    Mouse anti-aSMA-Cy3 Sigma-Aldrich C6198 Primary antibody
    Rabbit anti-CD3 Sigma-Aldrich C7930 Primary antibody
    Guinea Pig anti-Ins DAKO A0564 Primary antibody
    Donkey anti GP-IRDye680 LI-COR Biosciences 926-32421 Secondary antibody
    Goat anti Rb-DyeLight750 Thermo Scientific 35570 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa594 Molecular Probes A-11076 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa488 Molecular Probes A-11008 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa594 Molecular Probes A-11012 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa680 Molecular Probes A-21076 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa750 Molecular Probes A-21039 Secondary antibody
    OPT Skyscan 3001 Bioptonics OPT-Scanner
    Leica MZ FLIII Leica Microsystems Stereomicroscope
    Leica Objective 0.5x Leica Microsystems 10446157
    Leica Camera adapter 1.0x Leica Microsystems 10445930
    EL6000 Metal Halide 11504115 Lightsource
    Liquid Light Guide 11504116
    Cuvette Hellma Analytics 6030-OG 55 x 55 x 52.5 mm
    Mirror Edmund Optics F68-334 50 x 50 mm
    Andor Ikon-M Andor Technology DU934N-BV Back-illuminated CCD
    Filterset Chroma Technology 41021-MZFLIII TXR, Alexa-594, Cy3
    Filterset Chroma Technology 41022-MZFLIII IRDye680, Alexa-680
    Filterset Chroma Technology 49037-MZFLIII Dylight750, Alexa-750
    ProteinG-Sepharose beads GE Healthcare 17-0618-01 Protein G Sepharose 4 Fast Flow
    Sodium Azide Sigma-Aldrich 08591 Sodium azide 0.1 M solution

    References

    1. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545, [pii] 296/5567/541 doi:10.1126/science.1068206 (2002).
    2. Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., & Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. doi:10.1109/TMI.2011.2161590 (2012).
    3. Hornblad, A., Cheddad, A., & Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208, doi:10.4161/isl.3.4.16417 (2011).
    4. Holmberg, D. & Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154, doi:10.1007/s00125-008-1140-7 (2008).
    5. Ahlgren, U. & Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57, doi:10.1007/978-90-481-3271-3_3 (2010).
    6. Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228, doi:10.1146/annurev.bioeng.6.040803.140210 (2004).
    7. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33, [pii] nmeth985 doi:10.1038/nmeth985 (2007).
    8. Alanentalo, T., et al. High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas. J. Biomed. Opt. 13, 054070, doi:10.1117/1.3000430 (2008).
    9. Alanentalo, T., et al. Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes. Diabetes. 59, 1756-1764, doi:10.2337/Db09-1400 (2010).
    10. Sun, G., et al. Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo. Diabetologia. 53, 924-936, doi:10.1007/s00125-010-1692-1 (2010).
    11. Hornblad, A., Eriksson, A.U., Sock, E., Hill, R.E., & Ahlgren, U. Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas. PLoS One. 6, e21753, [pii] PONE-D-11-06725 doi:10.1371/journal.pone.0021753 (2011).
    12. Lindström, P. The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice). The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).
    13. Bock, T., Pakkenberg, B., & Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54, 133-137 (2005).

    Comments

    1 Comment

    Very interesting. this is not my field of study but I believe that your work is very important and it blows my mind. Christoffer Svensson, We know who has the BIG brains in the family. Congratulations on all your success and hard work I am proud of you. One day you have to take a couple of hours and sit down and explain it to me.
    Reply

    Posted by: Alexander S.January 15, 2013, 1:07 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter