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 JoVE Chemistry

Unchelated 가돌리늄위한 앱 타머 기반 센서 (III)

1, 1, 1, 1, 1

1Department of Chemistry and Biochemistry, California State University, East Bay

Article
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    Summary

    Cite this Article

    Edogun, O., Chan, T. Y., Nguyen, N. H., Luu, A., Halim, M. An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III). J. Vis. Exp. (119), e55216, doi:10.3791/55216 (2017).

    Introduction

    기술의 고유의 감도에 의해 제한된다 임상 진단에서 자기 공명 영상 (MRI)의 중요성이 증가는 신규 가돌리늄 계 조영제 (GBCAs 1)의 개발에 대한 연구의 빠른 성장을 가져왔다. GBCAs은 이미지 품질을 개선하기 위해 투여되는 분자이며, 그들은 일반적으로 여러 자리 리간드에 배위 3가 가돌리늄 이온 (하나님 3+)의 화학 구조를 갖는다. 이 복합체는 독성 3+ unchelated 하나님으로 매우 중요합니다; 이는 신장 질환 또는 장애이 일부 환자에서 신원 성 전신 섬유증의 발병과 연관되어있다. 따라서, 수성 자유 이온을 검출하는 GBCAs의 안전을 확보하는 수단이있다. GBCA 솔루션 unchelated 하나님 3+의 존재는 종종 리간드 및 이온 복합체의 해리 또는 displacemen 간의 불완전한 반응의 결과다른 생물학적 금속 양이온 (3)에 의한 t.

    현재 하나님 3+, 융통성 및 적응성 (4)의 측면에서 크로마토 그래피 및 / 또는 분광 최고 순위를 의존들의 존재를 결정하기 위해 사용하는 여러 기술 중. 강점 중 높은 감도 및 정확도 (리스트를, 복수 하나님 3+ 복합체의 동시 정량 (인간 혈청 5 소변 헤어 6 폐수 7 및 조영제 제제 8 등) 다양한 시료 매트릭스를 분석하는 능력이다 연구의 2013 년 이전은 Telgmann 등.) (4)에 의해 종합적인 검토에 설명되어 있습니다. 유일한 단점은 이들 방법 중 몇몇은 몇몇 실험실에 액세스 할 수있다 (예 : 유도 결합 플라즈마 질량 분석)을 측정 장치 (4)를 필요로한다는 것이다. 연구 및 개념 증명 수준 AR에 참신한 GBCA 검색의 맥락elatively 더욱 편리하고 신속하고 비용 효율적인 분광 기반 방법 (예 : 비스 - UV 흡수 또는 형광 등) 유용한 대안이 될 수있다. 마음에 이러한 응용 프로그램으로, 수성 하나님 3+에 대한 형광 앱 타머 기반 센서 (9)을 개발 하였다.

    앱 타머 (GD-앱 타머)는 지수 농축 (SELEX) (9)에 의한 리간드의 체계적인 진화의 과정을 통해 분리하여 염기의 특정 순서와 44 염기 길이의 단일 가닥 DNA 분자이다. 형광 센서에 앱 타머에 적응하기 위해, 형광 물질은 13 상보적인 염기 (도 1)를 통해 급냉 스트랜드 (QS)와 혼성화되는 가닥의 5 '말단에 부착된다. QS는 3 '말단에 어두운 소광 분자 태그입니다. 1 이루어지는 하나님 3+ 센서 (GD-센서)의 부재에있어서 : 각각 GD-앱 타머 및 QS 2 몰비 최소 형광 방출 인해 t있을 것이다소광에 형광에서 오 에너지 전달. 수성 하나님 3+의 첨가는 형광 방출 증가의 결과로, GD-앱 타머에서 QS를 대체 할 것이다.

    그림 1
    형광 (형광)과 dabcyl 태그로 13베이스 긴 담금질 가닥 (QS) 태그로 44베이스 긴 앱 타머 (GD-앱 타머) (어두운 소광)로 구성되어 그림 1. 센서 (하나님 센서) . unchelated 하나님 3+의 부재에서, 센서의 형광이 최소이다. 하나님 3+의 첨가에 의해, QS의 변위가 발생하고, 형광 발광의 증가가 관찰된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    현재 존재 한 일반적으로 사용되는 광학적 기반 방법에 대한 검출수성 하나님의 3 이상을 보내고. 이 분석은 이온 10 킬에 따라 433 nm의 573에서 최대 흡수 파장의 변화를 겪는다 분자 크 실레 놀 오렌지를 사용합니다. 이들 두 흡수 최대 값의 비율은 unchelated 하나님 3+의 양을 정량화 할 수있다. 두 가지 방법은, 타겟 선택도, 정량 분석의 선형 범위 및 검출 양상 (예 : pH 및 사용되는 버퍼 용액의 조성과 같은) 상이한 반응 조건을 가지고, 상기 앱 타머 센서는 크 실레 놀 오렌지 분석에 대한 대안 (또는 보완 될 수있다)는 9.

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    Protocol

    참고 : 분자 생물학 수준의 물이 모든 버퍼 및 솔루션 준비에 사용됩니다. 모든 일회용 튜브 (마이크로 원심과 PCR) 및 피펫 팁 DNase-과의 RNase-무료입니다. 사용하기 전에 모든 화학 물질에 대한 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 사용하는 것이 좋습니다.

    앱타 머는 재고 솔루션 1. 준비

    1. 상업적으로 polydeoxynucleotide의 2 가닥을 구입합니다. 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)로 정제와 두 가닥을 주문한다.
      1 (GD-앱 타머를) 가닥 :
      5 '- / 56 FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
      스트랜드 2 (QS) :
      5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 '
    2. 하나님 - 앱 타머 및 QS 100 μM 각각의 원액을 물에 각각의 가닥을 녹인다.
    3. -20 ° C에서 이러한 솔루션을 저장합니다. 솔루션은 지금까지 3 년 동안 안정하다.
    4. FREEZ을 최소화하기 위해전자 해동 사이클, 10 μL 씩의 주식 솔루션을 저장합니다.

    2 배속 하나님 센서 솔루션의 2. 준비

    1. 상기 분석 버퍼를 준비한다 (20 mM의 HEPES, 2 밀리미터의 MgCl 2, 150 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을). 수산화 나트륨과 염산으로 pH를에 ~ 7.4를 조정하고 0.2 μm의 PES 막으로 멸균 일회용 병 톱 필터를 통해 필터링합니다. 멸균 병에 보관합니다. 여과하고 (실온에서) 제대로 저장하는 경우, 버퍼는 지금까지 2 년 동안 안정하다.
    2. 분석 버퍼 497 μL와 (단계 1.2)에 QS 원액의 2 μL (단계 1.2)에 하나님 - 앱 타머 주식 솔루션의 1 μL를 희석. 소용돌이를 사용하여 잘 섞는다. 배속 GD-센서 용액에서의 농도는 각각 200, 400㎚이다.
      주 - 검량선 및 조영제 솔루션 3+ 하나님 7이 다양한 농도에서 제조 한 배 GD-센서 용액의 부피는 6을 테스트하기에 충분한 500 μL 인(단계 3). 각 샘플은 384 웰 플레이트에 중복 우물을 줄 것이다.
      1. 시험해야 하나님 3+ 솔루션의 수에 따라 2 배 GD-센서 용액의 양을 조정한다.
    3. 각 튜브에 50 μL로, 9 PCR 튜브에 2 배 하나님 센서 솔루션을 전송합니다. 열 자전거 타는 사람에 튜브를 놓습니다.
    4. 95 ° C로 튜브 용액을 가열하는 열 자전거 타는 사람에 프로그램을 설정, 5 분 동안 유지 한 후 천천히의 속도로 (15 분 ~ 동안 25 ° C에 솔루션을 냉각 ~ 0.05-0.1 ° C / 에스). 가열 및 냉각 사이클은 하나님-앱 타머와 QS 사이의 최적의 하이브리드을 보장하는 것입니다. 불완전 담금질하고 센서의 높은 배경 형광 부분 혼성화 결과. 열 사이 클러를 사용할 수없는 경우, 대신에 뜨거운 물이 욕을 사용하여이 과정을 수행한다.
    5. 일단 25 ℃까지 냉각하고, 즉시 용액을 사용하거나 할 준비가 될 때까지 (약 2 시간까지) 열 사이 클러에 보관익숙한. 수욕은 가열에 사용하는 경우에는 물을 서서히 실온으로 냉각대로 용기에 튜브를 떠난다.

    3. 형광 교정 곡선을 구축하고 하나님 대비 에이전트의 솔루션에 3+ Unchelated 하나님의 존재를 감지

    1. 상기 분석 버퍼 고체 GdCl 3 (단계 2.1에서와 같은 버퍼)에 녹인다.
    2. 시리얼 희석 통해 검량선 (2 × 용액)에 대해 원하는 최종 농도의 100 배에 μL 마이크로 원심 튜브 6 다른 하나님 3+ 용액을 각각 준비한다.
      1. 예를 들어, 0에 대한 보정을 구성, 50, 100, 200, 400 (NO GdCl 3 만 버퍼링)하고 하나님 3+ 800 nM의 0, 100, 200, 400, 800 및 1600 nM의 함유 용액을 제조 이온의. 확인은 음성 대조군 0 nM의 하나님 3+와 '빈'을 항상 포함 할 수 있습니다.
    3. 시험 될 조영제 녹이고분석 버퍼에 에드. 일련의 희석을 통해 조영제 용액의 2 또는 3 개의 농도를 준비한다.
      참고 : 조영제 솔루션의 3 가지 농도를 테스트하는 것이 좋습니다. 이것은 이러한 농도는 선형 범위 내에 있도록한다. 선형 관계를 표시하지 않은 시험 샘플은, 조영제의 농도를 감소하는 경우 사용된다.
    4. 열 자전거 타는 사람 중 단계 2.5에서 2 배 하나님 센서 솔루션을 포함하는 PCR 튜브를 타고.
    5. 2 배속 하나님 센서 솔루션을 포함하는 9 PCR 튜브 (6)에 단계 3.2에서 각각 하나님 3+ 용액 50 μL를 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다. 각 PCR 튜브는 이제 원하는 하나님 3+의 농도를 테스트 할, 100 nm의 하나님 - 앱 타머, 200 nm의 QS가 포함되어 있습니다.
    6. 배속 GD-센서 함유 용액 나머지 PCR 튜브에 단계 3.3에서 조영제 용액 50 μL를 추가한다. 최대 피펫 팅에 의해 몇 번 아래로 잘 섞는다.
    7. 의 S를 품어실온에서 약 5 분 동안 PCR 튜브에 olutions. 그들은 최대 30 분 동안 방치 될 수있다.
    8. 384 웰 플레이트에 각 튜브의 45 μL를 전송합니다. 각 PCR 튜브 중복 우물을 줄 것이다.
    9. 접시 리더에 각 웰의 형광을 기록합니다. 공급 업체의 웹 사이트에 나와있는대로 하나님 센서 설계에 사용되는 형광 물질 (FAM)는 각각 495과 520 나노 미터의 여기 및 방출 최대 값을 갖는다. 판 독자가 monochromator- 또는 필터 기반인지에 따라 적합한 여기 및 방출 파장 또는 필터를 선택합니다.
    10. 하나님 3+의 농도에 대한 임의의 형광 단위 (AFU)에서 형광의 그래프를 플롯.
    11. 하나님 3+의 농도에 대한 형광 배 변화와 그래프를 플롯. (하나님의 영 nM의 3 이상 포함) '빈'솔루션의 AFU 각 농도의 AFU을 나누어 형광 배의 변화를 계산한다. 형광 배의 변화는 N을 허용합니다결과 ormalization의 AFU 표시 일부주기 (다른 일 등)가 유사해야한다.
    12. 이 0 ㎚ GdCl 3 (단 버퍼)를 함유하는 용액 인 조영제를 함유하는 용액과 "빈"의 형광 방출을 비교한다.
      주 : GBCA 용액 높은 형광 조영제의 추가의 정제를 필요로 할 수있다 unchelated 하나님 3+의 존재를 의미한다. unchelated 하나님 3+의 양은 단계 3.10 3.11 구성된 검량선을 이용하여 추정 될 수있다.

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    Representative Results

    unchelated 하나님 3+의 존재 GD-센서 용액의 전형적인 형광 변화는도 2에 도시되어있다. 방출은 형광 배 변화 (그림 2A) 또는 임의의 단위로 읽기 원시 형광 (그림 2B)로 나타내 어질 수 (AFU). 두 플롯> 3 μM에서 신호의 1 μM 및 채도 아래 하나님의 농도에 대한 선형 범위 3+와 매우 유사 교정 곡선을 얻었다. 검출 한계는 3 신호대 잡음비와 ~ 100 ㎚이다.

    관심 GBCA를 함유하는 용액에서 unchelated 하나님 3+의 존재는 "빈"솔루션에 비해 센서의 형광의 증가로 변환된다. 하나님-DOTA 단지, 다른 것보다 더 높은 순도의 하나의 2 개의 다른 배치의 솔루션 형광 변화는 쇼입니다n 개의 대표적인 결과의 예로서 (그림 3). GD-DOTA (gadoteric 산) 상용 조영제에서 발견되는 유기 리간드에 의해 둘러싸여 DOTA GD의 가돌리늄 착물 3+이다. 높은 순도의 배치는 하나님-DOTA의 20 mM의 배출까지의 상당한 증가를 표시하지 않습니다. unchelated 하나님 3+가 존재하는 경우에도 5 밀리미터 이하 GD-DOTA 농도에서 눈에 띄는 변화가 관찰된다. 데이터 포인트는 센서의 형광 배 변화로서 플롯이 예에서는 unchelated 하나님 3+의 양의 정량화는도 2a의 검량선을 이용하여 추정 될 수있다.

    그림 2
    도 2 주제 GD-센서 형광 검량선 플롯. 모든 데이터 포인트를 두번 이상 수행하고, 평균 값을 플롯오차 막대와 같은 표준 편차 테드. (A) 검량선 100 nM의 GD-앱 타머 내지 200nm QS를 사용하여 획득. 그래프는 Y 축으로 형광 배 변화 플롯. (B), Y 축과 같은 임의 단위 (AFU) 원시 형광성 (A)과 동일한 검량선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 3
    도 3 주제 GD-센서 형광 변화 GD-DOTA 분자 샘플 unchelated 하나님 3+의 존재를 테스트. 하나님-DOTA 복잡한 솔루션의 두 개의 서로 다른 배치가이 음모에 표시됩니다, 높은 순도 (원 마커) 및 다른 포함 unchelated 하나님 3+ 중 하나 (파란색 triangl전자 마커). 각 데이터 포인트는 오차 막대와 같은 표준 편차를 두 측정의 평균이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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    Discussion

    앱타 머는 기반 GD-센서 관측 unchelated 하나님 3+의 농도에 비례하는 형광 방출의 증가 사용. 사용한 시료의 양을 최소화하기 위해, 분석은 웰 당 45 μL의 총 샘플 부피의 384 웰 마이크로 플레이트에서 실행될 수있다. 이 설계에서, 플루오 레세 인 (FAM) 및 dabcyl DAB ()의 선택은 주로 시약의 비용에 기초 하였다 발광 파장, 형광의 다른 쌍을 수정 및 소광 제 (11)를 사용할 수있다.

    이것은 센서 최상의 결과를 얻을 것을 주목하는 것이 중요하다 중요한 단계 중 하나는 GD-앱 타머 및 QS 사이의 최적의 하이브리드 화를 달성하는 분석 완충액에서 95 ° C 및 서냉 (단계 2.4)에 대한 가열은 가닥. 이전의 프로토콜에서 언급 한 바와 같이 열 순환기를 사용할 수없는 경우, 95 ℃에서 항온 수조에서 수행 될 수있다. 제어하는 또 다른 주요 매개 변수는 t입니다그 버퍼 용액의 조성; 조영제를 용해 단계 2.1에 기재된 분석 완충액의 사용은 권장 또는 탈 이온수를 사용할 수도있다. 그러나, 잠재적 인 간섭 물질을 포함하는 솔루션은 피해야한다. 그러한 버퍼의 예 3+ unchelated와 Gd 조정할 수 불용성 가돌리늄 포스페이트 (12)을 형성하는 인산 음이온을 포함 하나. 침전물 위음성 결과 센서와 반응하지 않을 것이다.

    실험에서 몇 단계의 결과에 영향을주지 않고 변형 될 수있다. 먼저, 분석 및 계산을 단순화 GD-센서 용액 및 2 배의 농도로 검량선 용 수성 GdCl 모두를 제조 하였다. 원하는 경우, 다른 희석 요인 GD-앱 타머의 최종 분석 농도 및 QS 각각 100 nM 내지 200 nm에서 유지되는 것을 제공 (예를 들어, 10 배의 용액)을 사용할 수있다. 둘째, 어 세이 버퍼 (D)히어로 정확히 pH가 7.4가 될 필요가 없습니다. 7 사이의 값 - 7.4만큼 동일한 완충액 실험에서 사용 된 바와 같이, 원하는 형광 증가를 생산할 것이다. 형광 발광 판독이 획득되면 셋째, 데이터 포인트가 임의의 단위 원 형광 (AFU) 또는 형광 배 변화로서 어느 플롯 될 수있다. 형광 배의 변화를 계산하려면 각 농도의 원시 형광 판독은 음성 대조군 (0 nm의 하나님 3+)의 (로 나눈 값) 독서에 정상화된다. 도 2AB에 도시 된 바와 같이, 양 플롯에서의 형광 방출 경향은 거의 동일하다. 플레이트 판독기가 다른 시간에 기록 된 원시 수치의 일부 변형을 표시하면 배 변화 데이터를 분석하는 편리한 방식 일 수있다. 실험실은 형광 아니라 플레이트 판독기가 장착되어있는 경우 마지막으로, 각 데이터 포인트는 마이크로 대신에, 큐벳을 사용하여 측정 될 수있다. 크기에 따라 오가능한 큐벳 F를 분석에서 제조 한 용액의 양을 조정할 필요가있다.

    본원에보고 된 방법은 chromatographic-의 대안을 제공 및 / 또는 수성 하나님 3+를 검출하기위한 분석법 기반 기술. 후자에 비해, GD-센서 분석은 여러 종의 동시 검출을위한 민감도, 정확도 및 기능면에서 더욱 제한된다. 한편, 분광 기반 센서는 아마도 더 쉽게 사용할 짧은 시간 내에 수행 될 수있을 수있는 수단을 필요로하고, 샘플 준비는 최소이다. 조영제는 단순히 GD-센서 용액과 혼합 완충액에 용해 될 수 있고, 형광 발광을 직접 측정했다. 또한, 센서는 크 실레 놀 오렌지 표시기 (두 방법 사이의 크기 차이는 약 2 오더)보다도 3+ unchelated 하나님의 훨씬 더 낮은 농도를 검출 할 수있다 및여러 가지 다른 생물학적으로 중요하고 전이 금속 이온 9 위에 하나님 3+에 대한 높은 선택성.

    일부 실험 조건에서의 사용을 제한 할 수 있습니다이 분석의 두 가지 단점이 있습니다. 하나의 제한은 센서가 3+ 하나님 특정 없다는 것이다; 그것은 9 (예 : Eu2 +를하고 TB 3+ 등) 다른 란탄 족 이온에 대한 응답을 표시합니다. 그러나, 이들은 통상적으로 조영제 검색된 이온 또는 생물학적 시스템은 아니므로, 이들의 간섭을 최소화한다. 주목해야 할 두 번째 포인트는 하나님 3+의 하나님 센서 형광 방출의 점진적인 감소의 높은 농도 (10 ~ 위 μM)이 관찰된다는 점이다. 란탄 족 이온에 의해 급냉의 효과는 검출하고 (14)를 정량하기위한 기술로서 사용되어 온 잘 문서화 현상 (13)이다. 이것은 하나님의 높은 농도를 측정하는 센서의 효용을 제한하는 반면 3+

    본 연구에서는 수용액 독성 unchelated 하나님 3+를 검출하기위한 편리한 형광 기반 기술의 사용을 설명하고있다. 이 분석은 특히 시험 관내 실험 합성 및 배합시, 가돌리늄 계 조영제 순도의 초기 단계 평가를 의미한다. 진단에서 자기 공명 영상의 현재 성장과 함께, 새로운 조영제의 증가는 지속적으로 설계 및 테스트되고있다. 앱타 머는 기반 GD-센서 빠르게 주위의 pH에서 수용액 또는 미 해리 하나님 3+ 서브 마이크로 몰 농도의 존재를 검출하는 수단을 제공함으로써 이러한 개발을 촉진 할 것이다. 센서가 다른 가의 란타나 이드 이온과 교차 반응을 표시하기 때문에, 그 응용이 될 수있다연구의 이러한 영역을 확장했다.

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    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Gd-aptamer IDTDNA Input sequence and fluorophore modification in the order form A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
    Quenching strand IDTDNA Input sequence and quencher modification in the order form A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
    Molecular biology grade water No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
    Gadolinium(III) chloride anhydrous Strem 936416 Toxic
    HEPES Fisher Scientific BP310-500
    Magnesium chloride anhydrous MP Biomedicals 0520984480 - 100 g
    Sodium Chloride Acros Organics 327300025
    Potassium chloride Fisher Scientific P333-500
    Sodium hydroxide, pellets Fisher Scientific BP359 Corrosive
    Hydrochloric acid Fisher Scientific SA49 Toxic and corrosive
    384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates Corning 3575 Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
    Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter Thermo Scientific 5680020 The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane
    Disposable sterile bottles 250 mL Corning 430281 A larger or smaller bottle may be used
    1.5 mL microcentrifuge tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    0.2 mL PCR tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    Micropipets No specific manufacturer
    Pipet tips (non filter) of appropriate sizes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    Equipment
    Plate reader Biotek Synergy H1 Plate readers from other manufacturers would work equally well

    References

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