The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
1Biomedical Engineering Department, Cornell University, 2Neurosurgical Laboratory for Translational Stem Cell Research, Weill Cornell Brain Tumor Center, Weill Cornell Medical College of Cornell University, 3Cell Morphology Department, Instituto de Investigacion Principe Felipe, 4Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 50.16.132.180, User IP: 50.16.132.180, User IP Hex: 839943348
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Wong, K., Ayuso-Sacido, A., Ahyow, P., Darling, A., Boockvar, J. A., Wu, M. Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (12), e674, doi:10.3791/674 (2008).
בעוד הטכנולוגיה microfluidic הוא להגיע לרמה חדשה של בגרות עבור מבחני macromolecular, מבוססי תאים מבחני נמצאים עדיין בשלב תינוק 1. זהו בעיקר בשל הקושי שבה ניתן ליצור microenvironment תא תואם ויציב באמצעות טכניקות microfabrication קונבנציונאלי וחומרים. אנו לטפל בבעיה זו באמצעות הקדמה של חומר microfabrication רומן, agarose ג'ל, כחומר בסיס עבור המכשיר microfluidic. Agarose ג'ל הוא נזיל מאוד, החדיר את גז וחומרים מזינים הנחוצים להישרדות התא, ובכך חומר אידיאלי עבור מבוססי תאים מבחני. הראינו בעבר כי agarose מכשירים מבוססי ג'ל הצליחו ללמוד נדידת תאים חיידקיים נויטרופילים 2. בדו"ח זה, בשלושה ערוצים מקבילים microfluidic הם בדוגמת בקרום ג'ל agarose בעובי 1 מ"מ בערך. תזרים קבוע עם התקשורת / חיץ נשמרים בשני ערוצי הצד באמצעות משאבת peristaltic. תאים נשמרים בערוץ במרכז לצורך השגחה. מאז מזינים וכימיקלים בערוצים לוואי לשדר כל הזמן מהצד למרכז הערוץ, את הסביבה הכימית של הערוץ במרכז נשלטים בקלות באמצעות זרימת לאורך תעלות הצד. שימוש במכשיר זה, אנו מראים כי תנועת בתאי גזע עצביים ניתן לנטר אופטית בקלות בתנאים כימיים שונים, את תוצאות הניסוי הראו כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים. תנועתיות של בתאי גזע עצביים הוא סמן חשוב להערכת האגרסיביות תאים, ובכך גורם tumorigenic 3. פיענוח המנגנון הבסיסי תנועתיות NSC תניב תובנה הן הפרעות התפתחות סרטן עצביים אל המוח הפלישה בתאי גזע.
נוהל
ציפוי שקופיות עם פיברונקטין
לפני ההרכבה של המכשיר microfluidic, לעקר שקופיות הזכוכית עם פיברונקטין. המעיל שקופיות biohood לשמור על סטריליות. יישר spacer סטרילי PDMS בשולי השקופית ולסמן את הצד שהוא פונה כלפי מעלה עם סמן קבע. פיפטה 1 מ"ל של פתרון מיקרוגרם / 5 מ"ל של פיברונקטין (Sigma) בתוך spacer PDMS על מכלול שקופיות הזכוכית. השאירו את השקופיות ללא הפרעה במשך שעה, ואז להתייבש לחלוטין באמצעות אקדח 2 N. השקופיות ניתן לאחסן 4 o C עבור ניסויים מאוחר יותר.
הרכבת מכשיר
פרוטוקול כולו הרכבה המכשיר נעשית biohood בתנאים סטריליים, באמצעות הפעולות הבאות:
הכנה מתזמן את התאים למכשיר
כאשר התאים מגיעים 70% (צפיפות התאים סביב 100,000 תאים / מ"ל) confluency, הם מוכנים להיות seeded לתוך המכשיר.
נושא התאים לשני DPBS (Invitrogen) שוטף. הוסף 200 μl של טריפסין-EDTA (Invitrogen) לנתק את התאים. העברת התאים צינור המכיל 15 מ"ל צנטריפוגות 5 מ"ל של התקשורת M2 המכילה סרום להשבית טריפסין. Centrifuged התקשורת צמיחה עם התאים על 1000 סל"ד במשך 5 דקות. Aspirated את supernatant ו resuspend גלולה של תאים 5 מ"ל של DPBS. צנטריפוגה התאים DPBS שוב באותם תנאים. Aspirated את supernatant שוב, resuspend גלולה של תא 500 μl של CO 2-מדיה עצמאית.
זרעים ההשעיה וכתוצאה מכך התאים למרכז microchannel של המכשיר באמצעות זרימת הכבידה מונע. מוסיפים את כניסת ו לשקע של מרכז microchannel עם 60 μl של השעיה על התא 20 μl של המדיום 2-CO עצמאיים, בהתאמה. שים לב מרכז microchannel תחת מיקרוסקופ brightfield לחפש הידבקות התא. התאים בדרך כלל לדבוק אחרי 10 דקות. אחרי התאים להיצמד לתחתית הערוץ בצפיפות ראויה, pipeted את ההשעיה תא שנותרו כניסת ואת התקשורת לשקע. מקום 60 μl של CO2 עצמאית התקשורת וגם לשקע כניסת הערוץ למרכז. המקום משתרע על פני ה PDMSדואר כניסת מרכז לשקע כדי למזער את התאדות של התקשורת מערוץ מרכז.
הדמיה התאים למכשיר
לפני ההרכבה של המכשיר, החוט צינורות peristaltic סטרילית דרך תחנת מזג האוויר של המיקרוסקופ (אולימפוס X81) ולהתחבר עם המשאבה peristaltic (ווטסון, מרלו 205U/CA). פלאש PBS דרך צינורות בשיעור של 4 סל"ד. לאחר ההרכבה של המכשיר, להכין ריכוזים מתאימים של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) (Sigma) פתרונות של 2-CO מדיה עצמאית ב 15 מבחנות צנטריפוגה מ"ל. וורטקס EGF פתרונות עבור 5 שניות להתחבר עם צינור. חבר את tubings המסומנים ריכוזי EGF המתאים למכשיר. זה לוקח בערך שעה עבור EGF כדי מפוזר על פני הרכס ערוץ ולהקים שיפוע כימי יציב.
תוכנת הדמיה, Slidebook, הוא נהג לקחת סדרה של תמונות על כל 10 דקות במשך כ 5 שעות בטווח ניסיונית. השלב xy אוטומטי מתוכנת כך כי שני אזורי משנה (כל אחד עם שטח של x400μm 400μm) של הערוץ אותו מוקד, וכן סך של שלושת הערוצים הם צילמו במרכז בנקודת זמן נתונה. תאים ערוצי מרכז שונים (בדרך כלל 3 בטווח אחד) יש ריכוזים EGF שונים, המסומנים על הצינור.
חומרים וציוד
שורות תאים: תאים C17.2 NSCs נגזר השכבה החיצונית של המוח הקטן נבטי עכבר הלידה 6, 7. באמצעות קו זה התא, פיתחנו שני האחרים Murine בתאי גזע קווי transfection באמצעות שיטת רטרווירוס. שתי השורות הללו ביציבות התא transfected הם (1) wtEGFR - כי מעל מבטא את EGFR אדם סוג בר, (2) ΔEGFR - כלומר מוטציה EGFR פעיל constitutively. על מנת להקל על הזיהוי, רטרווירוסים לשאת השדרה עם הגן של אינטרסים ואחריו אתר פנימי מחייב ריבוזומלי (IRES) לבין חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).
Cell תרבות: C17.2 העכבר NSCs וגירסאות שלהם גדלו צלחת 6-באר M2 מדיה (DMEM (Invitrogen) עם 10% בסרום שור העובר (FBS) (Invitrogen), סוס בסרום 5% (ש"מ) (Invitrogen ), ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (Invitrogen).) תאים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס באוויר 80% ו 5% CO 2.
המכשיר microfluidic: סעפת פלסטיק, spacer PDMS, ואת מסגרת נירוסטה להחזקת המכשיר במקום.
הדמיה
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה (אולימפוס IX-81) משמש, בקשר עם CCD התעצמה המצלמה (אורקה, Hamamatsu). המכשיר microfluidic הוא רכוב על הבמה XYZ אוטומטיות, והשלב מוקפת קאמרית סביבתיים שומרת על טמפרטורה של 37 o C. בדרך כלל יש 3-4 מכשירים על אותו שבב זה יהיה מצולם בנקודת זמן זהה באמצעות הבמה אוטומטיות xyz.
שמירה על תזרים
המשאבה peristaltic עם 8 קווים מקבילים (ווטסון, מרלו 205U/CA) אוטומטי משמש כדי לשמור על תזרים בכל הכיור ערוצי מקור.
איור. 1 תנועתיות של שלושה זנים NSC (הורים, wtEGFR, ו-D-EGFR) בריכוזים שונים EGF כל מסלולי לקוחים מעקב סרט של 5 שעות (למעט wtEGF 100ng/ml, 4hour), וכן את המקור של כל המסלולים היו מיקומו בבית (0,0) לצורך השוואה.
איור. 2 מתאם של רמת ביטוי EGFR ו - תנועתיות (א) שתי תמונות של NSCs wtEGF על פני השטח של ערוץ microfluidic עם 100ng/ml EGF. התמונה השמאלית היא תמונה ניאון, והזכות היא תמונה משודרים שדה בהיר. סרגל מידה הוא 100μm, ואת רוחב הערוץ הוא 400 מיקרומטר. תאים מופרדים לשתי האוכלוסיות על ידי בהירות ה-GFP הביעו. תאים בחוגים כחול הם עמומים, ובכך יש רמת ביטוי EGFR פחות; ותאי בחוגים באדום brigher, ובכך יש ביטוי ברמה גבוהה EGFR. (ב) מסלולים של תאים עם רמה נמוכה וגבוהה ביטוי EGFR. מסלולים אלו לקוחים מתוך סרט באורך שעה ארבע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
איור. 1 מראה מסלולים של שלושה זנים NSC, התאים הורית, wtEGFR ואת ΔEGFR (שליטה). כל סט של מסלולי התקבלו בסרט 5 שעות ארוכות. עבור תאים הורית, תנועתיות התא הגיע לשיאו כאשר ריכוז EGF היה ~ 10ng/ml; עבור תאים wtEGFR, תנועתיות שיא התא עבר 100ng/ml או לעיל; עבור תאים ΔEGFR, תנועתיות התא היה עצמאי של ריכוז EGF כצפוי.
התאים wtEGF עם 100ng/ml היו תאים ניעתי ביותר, הם עברו על 1.5 פעמים מהר יותר מאשר תאים עם ההורים 10ng/ml. זה מצביע על כך (1) על הביטוי של EGFR משפר את תנועתיות התאים, (2) את מספר EGF ליגנד לקולטן אירועים ממתין יש השפעה ישירה על תנועתיות התא. קו ΔEGFR התא הוא EGFR מוטנטי פעיל constitutively. מוטציה זו מופיעה ב 60% ~ של גליובלסטומה האדם. יש לו תחום תאי מקוצץ זה הופך קינאז מכוננת פעיל ליגנד עצמאית. עוצמת autophosphorylation הוא קטן (כ 10%) לעומת ליגנד מופעל wild-type EGFR (wtEGFR) 4. זה ביסוד תצפית כי תאי ΔEGF יש תנועתיות גבוהה במקצת מזו של ההורים wtEGFR (בהעדר EGF), אך תנועתיות נשמר קבוע בריכוזים שונים EGF.
מאז תאים wtEGFR נשאו עותקים זהה של ה-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) ו-EGFR, עוצמת ניאון של תאים wtEGFR לחשוף את הביטוי רמות EGFR. זה מאפשר לנו לקשר ישירות את החלבון EGFR ביטוי ברמה (עוצמת פלואורסצנטי ירוק) עם תנועתיות התא. איור. 2 מציג את מסלולי האוכלוסייה two התא, התאים עיגול אדום בהירים, ובכך יש ביטוי ברמה גבוהה EGFR, והתאים במעגל הכחול הם ארוחת הערב, ובכך יש ביטוי ברמה נמוכה EGFR. התוצאות שוב מוכיחים כי ככל שעולה רמת ביטוי EGFR, יותר ניעתי תאים אלה.
באופן מסורתי, תנועתיות של NSCs נקבע באמצעות assay קאמרית בוידן, שם אחוז תאים נודדים דרך קרום מוערך 5. זהו assay אוכלוסייה מבוססת, שבה התנהגות התא לא ניתן להעריך בנפרד. המכשיר microfluidic המוצג כאן מהווה הזדמנות ללמוד תנועה התא ברמת תא בודד, וגם בסביבה כימית מבוקרת היטב. זה מאפשר, לראשונה, כדי לתאם ישירות את החלבון EGFR ביטוי ברמה עם פנוטיפ תנועתיות NSCs בתאים חיים. גודלו הקטן של המכשיר הוא שימושי במיוחד עבור ניסויים שבהם תאים מקורות מוגבלים, כגון לתאי גזע אנושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
עבודה זו נתמכת על ידי משרד של מדינת ניו יורק למדע, טכנולוגיה ומחקר אקדמי (NYSTAR) (בצורה של מרכז עבור טכנולוגיה מתקדמת מענק), וכן על ידי מענקים ממרכז Nanobiotechnology (NBTC), תוכנית STC הלאומי קרן המדע על פי הסכם מס 'ECS-9876771, והמוח האמריקאי גידול עורכי הדין בניו יורק, האקדמיה לרפואה (ג'ב).
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
1. Blow, N., Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods, 2007. 4(8): p. 665-670.
2. Shing-Yi Cheng, S.H., Max Wassweman, Shivaun Archer, Michael L. Shuler and Mingming Wu, A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip, 2007. 7: p. 763-769.
3. Pedersen, M.W., V. Tkach, N. Pedersen, V. Berezin, and H.S. Poulsen, Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer, 2004. 108(5): p. 643-53.
4. Ayuso-Sacido, A., Graham, C.,Greenfield JP., Boockvar, JA., The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer? Current Stem Cell Research and Therapy, 2006. 1: p. 231-238.
5. Eisenbach, M., C. Constantinou, H. Aloni, and M. Shinitzky, Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol, 1990. 172(9): p. 5218-24.
6. Snyder, E.Y., D.L. Deitcher, C. Walsh, S. Arnold-Aldea, E.A. Hartwieg, and C.L. Cepko, Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell, 1992. 68(1): p. 33-51.
7. Snyder, E.Y., C. Yoon, J.D. Flax, and J.D. Macklis, Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(21): p. 11663-8.
Hi, I'm Nocchi Linda (PhD)
how can I extract DNA from cellular culture in agarose gel? Is there a protocol to do it?
Thanks a lot.
1
ReplyPosted by: Nocchi LindaFebruary 4, 2009, 6:06 AM