La evaluación de la motilidad de células madre neurales uso de un gel de agarosa al dispositivo basado en microfluídica

Procedimiento

Diapositivas recubrimiento con fibronectina

Antes de la reunión de los dispositivos de microfluidos, esterilizar a las diapositivas de cristal con la fibronectina. Escudo de las diapositivas en una biohood para mantener la esterilidad. Alinear un espaciador PDMS estéril a lo largo de los bordes de la diapositiva y marcar el lado que está hacia arriba, con un marcador permanente. Pipeta de 1 ml de 5 mg / ml de solución de fibronectina (Sigma) en el interior del espaciador de PDMS sobre la totalidad de la lámina de vidrio. Deje los portaobjetos en reposo durante una hora, luego se seca por completo con una pistola de N _2. Las diapositivas se pueden almacenar a ⁴ º C para posteriores experimentos.

Montaje del dispositivo

El protocolo de dispositivo conjunto está realizado en un biohood en condiciones estériles, mediante los siguientes procedimientos:

1. Limpie el maestro de silicio con el patrón de microcanales que frotándolo hasta con el 70% de etanol y secado con el N ₂ armas de fuego. Coloque un espaciador PDMS estéril de altura de 1 mm con pinza en torno a las funciones de ayuda del maestro.
2. Preparar el gel de agarosa utilizado en el dispositivo por un peso de 0,3 g de polvo de agarosa (Fisher Scientific) y 10 ml de CO _2-medios de comunicación independientes (Invitrogen) en un vaso de 50 ml. Revuelva la mezcla con una espátula y el calor en el microondas durante 20 segundos a potencia ALTA. Si los gránulos disueltos están presentes, calentar la mezcla durante 10 segundos y agitar la mezcla caliente para deshacerse de los gránulos restantes. Repita el proceso con un tiempo de calentamiento de 8 segundos, y luego 5 segundos.
3. Rápidamente verter la solución de agarosa en el patrón de silicio rodeado por el separador de PDMS y cubrir inmediatamente la mezcla de agarosa con un portaobjetos de vidrio estéril. Aplique una presión constante y suave a la diapositiva durante unos 2 minutos para asegurarse de que el gel de agarosa se a la misma altura constante de 1 mm como espaciador PDMS.
4. Después de los geles de agarosa, retire el gel de agarosa al patrón con el espaciador PDMS del maestro de silicio y la transferencia de un portaobjetos de vidrio recubiertas con fibronectina los microcanales en el gel de agarosa al frente de la diapositiva. Utilice una punta de la jeringa de calibre 16 para perforar agujeros en las regiones de reserva de los microcanales de los accesos de entrada y salida. Añadir 500 l de CO _2-medios de comunicación independientes en el gel de agarosa al patrón de la diapositiva para evitar la desecación de los microcanales.
5. Lavar el colector de acrílico utilizado en el dispositivo con el 70% de etanol y enjuague con agua DI. Alinee los orificios de la variedad, que los agujeros perforados en el gel de agarosa con los microcanales. A continuación, alinee el colector con el gel, el separador PDMS, y la caída de fibronectina con la estructura metálica del aparato. Coloque los tornillos en el dispositivo y apretar hasta el punto de resistencia con un destornillador. Esto se hace para asegurar que el dispositivo no está demasiado ajustado en la medida de la deformación de los microcanales de la agarosa. Apriete los tornillos en un orden hacia la derecha para asegurarse de que el gel en el interior del dispositivo no se mueva. Pruebe el dispositivo para detectar fugas y obstrucciones en los microcanales con una jeringa de 1 ml. La jeringa está equipado con tubos de Tygon con una punta de la pipeta de gel de carga en el extremo del tubo para inyectar CO _2-medios de comunicación independientes en los microcanales. Un micro se considera formado con éxito cuando los medios se observa que la única salida de la toma de la microcanal cuando los medios de comunicación se inyecta en la entrada correspondiente. Ahora, el dispositivo está listo para su uso.

Preparar y sembrar las células en el dispositivo

Cuando las células alcanzan el 70% (la densidad de células alrededor de 100.000 células / ml) de confluencia, que están preparados para ser cabeza de serie en el dispositivo.

Sujeto a las células a dos DPBS (Invitrogen) lavadas. Añadir 200 l de tripsina-EDTA (Invitrogen) para separar las células. Transferencia de las células a un tubo de centrífuga de 15 ml que contienen 5 ml de los medios de comunicación M2 que contiene el suero para inactivar la tripsina. Centrifugó el medio de cultivo con las células a 1000 rpm durante 5 minutos. Aspiración el sobrenadante y resuspender el precipitado de células 5 ml de DPBS. Centrifugar las células DPBS nuevo en las mismas condiciones. Aspiración el sobrenadante de nuevo, y resuspender el precipitado de células en 500 l de CO _2-medios de comunicación independientes.

Semilla de la suspensión resultante de células en el centro de microcanales del dispositivo a través de la gravedad impulsada por el flujo. Agregar la entrada y salida del centro de microcanal con 60 l de la suspensión celular y 20 l de CO _{2-independiente} medio, respectivamente. Observar el centro de microcanal con un microscopio de campo claro para buscar la adhesión celular. Las células generalmente se adhieren a los 10 minutos. Después las células se adhieren al fondo del canal, con una densidad adecuada, pipeted a cabo la suspensión de células que permanecen en la entrada y los medios de comunicación en la toma de corriente. Lugar 60 l de CO _2-medios de comunicación independientes, tanto de entrada y salida del canal central. Lugar PDMS cubre más de the entrada y salida del centro para minimizar la evaporación de los medios de comunicación desde el canal central.

Imágenes de las células en el dispositivo

Antes de la asamblea del dispositivo, pase el tubo peristáltico estéril a través de la estación meteorológica del microscopio (Olympus X81) y conectarse con la bomba peristáltica (Watson-Marlow 205U/CA). Ras PBS a través del tubo a una velocidad de 4 RPM. Después de que el montaje del dispositivo, preparar las concentraciones de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Sigma) en las soluciones de las emisiones de CO _2-medios de comunicación independientes en un 15 tubos de centrifugación ml. Vortex del FEAG soluciones durante 5 segundos y conectar con la tubería. Conectar los tubos marcados con las concentraciones de FCE correspondiente al dispositivo. Se tarda aproximadamente una hora para el FEAG para difundir a través del canal del canal y establecer un gradiente químico estable.

Un software de imagen, Slidebook, se utiliza para tomar un conjunto de imágenes cada 10 minutos durante 5 horas en una carrera experimental. La etapa xy automático está programado de tal manera que dos sub-zonas (cada uno con un área de x400μm 400μm) del canal del mismo centro, y un total de tres canales centrales son expuestas en un momento dado. Las células en los canales de centro diferente (normalmente de 3 en una carrera) tiene diferentes concentraciones EGF, como está marcado en el tubo.

Materiales y Equipo

Líneas de células: las células se C17.2 NSCs derivados de la capa externa germinal del cerebelo de ratón postnatal ^{6, 7.} Siguiendo esta línea celular, se han desarrollado otras dos líneas de células madre murinas utilizando el método de transfección retrovirus. Estas dos líneas de células establemente transfectadas son (1) wtEGFR - que la sobre-expresa el EGFR humano de tipo salvaje, y (2) ΔEGFR - que es un mutante constitutivamente activa EGFR. Para facilitar la detección, los retrovirus tienen una columna vertebral con el gen de interés seguida por un sitio interno de unión al ribosoma (IRES) y la proteína verde fluorescente (GFP).

De cultivo celular: El ratón C17.2 NSCs y sus variantes fueron cultivadas en una placa de 6 pocillos en los medios de comunicación M2 (DMEM (Invitrogen) con fetal al 10% de suero bovino (SFB) (Invitrogen), el 5% de suero de caballo (HS) (Invitrogen ), y el 1% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen).) Las células se mantuvieron a ³⁷ º C en el 80% de aire y 5% de CO _2.

Microfluidos dispositivo: un colector de plástico, un separador de PDMS, y un marco de acero para sostener el dispositivo en su lugar.

Imágenes

Un microscopio invertido de fluorescencia (Olympus IX-81) se utiliza, en relación con una cámara CCD intensificada (Orca, Hamamatsu). El dispositivo de microfluidos está montado sobre un sistema automatizado de fase xyz, y el escenario está rodeado por una cámara ambiental que mantiene una temperatura de ³⁷ º C. Hay por lo general los dispositivos de 3-4 en el mismo chip que será filmado en el mismo momento con el automatizado etapa xyz.

Mantener el flujo de

Una bomba peristáltica con 8 líneas paralelas (Watson-Marlow 205U/CA) automático se utiliza para mantener los flujos en todas las de la pileta y canales de origen.

Fig. Una motilidad de tres cepas de NSC (padres, wtEGFR y EGFR D) en las concentraciones de diversos FEAG Todas las trayectorias se han tomado de seguimiento de una película de 5 horas (a excepción de wtEGF 100ng/ml, 4 horas), y fueron el origen de todas las pistas reposicionado en (0,0) para fines de comparación.

Fig. 2 Correlación del nivel de expresión del EGFR y la motilidad (a) dos imágenes de NSCs wtEGF en la superficie de un canal de microfluidos con 100ng/ml FEAG. La imagen de la izquierda es una imagen fluorescente, y el derecho es una imagen transmitida de campo claro. La barra de escala es 100μm, y el Anchura del canal es de 400 micras. Las células se separan en dos poblaciones por la luminosidad de la GFP expresado. Las células en los círculos azules son más débiles, por lo tanto tienen menos nivel de expresión del EGFR, y las células en los círculos rojos son brigher, por lo tanto tienen mayor nivel de expresión del EGFR. (B) Las trayectorias de las células con el nivel de EGFR expresión de alta y baja. Estas trayectorias se han tomado de una cuatro horas de duración de cine.

Fig. 1 muestra las trayectorias de tres cepas Consejo de Seguridad Nacional, las células de los padres, la wtEGFR y ΔEGFR el (control). Cada conjunto de trayectorias se obtuvieron de una película de 5 horas de duración. Para las células de los padres, la motilidad celular alcanzó su punto máximo cuando la concentración de EGF se ~ 10ng/ml, porque las células wtEGFR, el pico de motilidad celular pasó a 100ng/ml o superior, para que las células ΔEGFR, la motilidad celular es independiente de la concentración de FCE como se esperaba.

Las células wtEGF con 100ng/ml fueron las células más móviles, se movieron alrededor de 1,5 veces más rápido que las células de los padres con 10ng/ml. Esto indica que (1) sobre la expresión de EGFR incrementa la motilidad células, (2) el número de eventos esperando FEAG ligando-receptor tiene un impacto directo sobre la motilidad celular. Línea ΔEGFR celular es un mutante constitutivamente activa EGFR. Este mutante aparece en aproximadamente el 60% de los glioblastomas humanos. Tiene un dominio extracelular truncada que se convierte en un activo constitutiva ligando-independiente quinasa. La intensidad de la autofosforilación es pequeña (aproximadamente el 10%) en comparación con el ligando activa de tipo salvaje EGFR (wtEGFR) ^4. Esto subyace en la observación de que las células ΔEGF contar con movilidad ligeramente superior a la de los padres y wtEGFR (en ausencia de EGF), pero la movilidad se mantiene una constante en las concentraciones de diversos FEAG.

Dado que las células wtEGFR llevado mismas copias de la GFP (Green Fluorescent Protein) y EGFR, la intensidad de fluorescencia de las células wtEGFR revelan los niveles de expresión del EGFR. Esto nos permite relacionar directamente la proteína EGFR nivel de expresión (la intensidad de fluorescencia verde) con la motilidad celular. Fig. 2 muestra las trayectorias de la población de dos células, las células en el círculo rojo son más brillantes, por lo tanto tiene un nivel de expresión de EGFR, y las células en el círculo azul se cena, por lo tanto tiene un menor nivel de expresión del EGFR. Los resultados demuestran una vez más que cuanto mayor es el nivel de expresión del EGFR, más móviles que estas células son.

Tradicionalmente, la movilidad de los comités directivos nacionales se ha determinado mediante un ensayo de cámara de Boyden, donde se evalúa el porcentaje de células que migran a través de una membrana ^5. Este es un ensayo basado en la población, donde el comportamiento celular no puede ser evaluado individualmente. El dispositivo de microfluidos se muestra aquí es una oportunidad para estudiar el movimiento de células en un nivel de células individuales, y en un ambiente químico bien controlado. Le permite a uno, por primera vez, se correlacionan directamente con la proteína EGFR nivel de expresión con el fenotipo de la motilidad NSCs en las células vivas. El pequeño tamaño del dispositivo es especialmente útil para los experimentos en los que las fuentes de las células son limitados, tales como las células madre humanas.