The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Hindi was automatically generated through Google Translate.
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Center for Neuroscience, University of California, Davis
Woods, G., Zito, K. Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture. J. Vis. Exp. (12), e675, doi:10.3791/675 (2008).
BIOLISTIC अभिकर्मक के लिए प्रोटोकॉल
बुलेट बनाना
बुलेट 6 महीनों के लिए अच्छे हैं, लेकिन 2-3 महीनों के बाद अभिकर्मक दक्षता में कमी करने के लिए शुरू कर सकते हैं. बुलेट dessicant छर्रों की उपस्थिति में 4 ° C में संग्रहित किया जाना चाहिए. हमेशा जगमगाहट शीशियों, जिसमें बुलेट्स संग्रहीत किए जाते हैं शीशी खोलने से पहले कमरे के तापमान को गर्म करते हैं.
पहले शुरू हो रही तैयार है:
टयूबिंग तैयार:
सोने की माला पर डीएनए precipitating:
Sonication के दौरान PVP समाधान तैयार:
EtOH के साथ सोने के मोती Rinsing:
Resuspend / PVP समाधान में सोने डीएनए:
कोटिंग टयूबिंग:
टयूबिंग काटना:
ऊतक स्लाइस की शूटिंग
जब शूटिंग सुसंस्कृत स्लाइस, यह महत्वपूर्ण है एक अपेक्षाकृत बाँझ तकनीक रोजगार क्रम में संक्रमण से बचने. याद रखें, कि जब दो अलग अलग constructs शूटिंग, गोलियों की दोनों सेट समान कारतूस धारक में लोड किया जा सकता है, लेकिन बैरल लाइनर और स्क्रीन constructs के बीच परिवर्तित किया जाना चाहिए.
पहले शुरू हो रही तैयार है:
जीन बंदूक prepping:
जीन बंदूक के साथ शूटिंग सुसंस्कृत स्लाइस:
सफाई कारतूस धारकों और बैरल liners:
मुसीबत Biolistic अभिकर्मक के लिए शूटिंग युक्तियाँ
Biolistic अभिकर्मक कभी कभी suboptimal अभिकर्मक शर्तों में परिणाम कर सकते हैं . यह भी या कुछ भी कई कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट, बहुत अधिक या बहुत कम अभिव्यक्ति के स्तर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, या ऊतकों स्लाइस के कारण आम तौर पर अस्वस्थ हो सकता है. अक्सर दबाव विस्फोट से अस्वस्थ स्लाइस परिणाम. यहाँ कुछ सुझाव के लिए बेहतर ट्रांसफ़ेक्ट ऊतक स्लाइस प्राप्त हैं.
यदि स्लाइस अस्वस्थ हो सकता है (या अगर भी कई कोशिकाओं / टुकड़ा ट्रांसफ़ेक्ट हैं) की कोशिश करो, दिखाई देते हैं:
यदि भी कुछ कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं, की कोशिश:
यदि आप दोनों भी कई और भी कुछ एक ही शूटिंग के दौरान यह सुनिश्चित कर लें ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ स्लाइसें प्राप्त
यदि अभिकर्मक दक्षता इष्टतम लगता है (# कोशिकाओं / टुकड़ा ट्रांसफ़ेक्ट), लेकिन अभिव्यक्ति के स्तर को बहुत अधिक या बहुत कम लगता है:
दोहरी अभिकर्मक के मामले में, यदि आप अपने constructs की अभिव्यक्ति बहुत कम हो रही है, उचित ढंग से दो constructs के अनुपात को समायोजित और है कि दोनों constructs एक ही प्रमोटर के तहत कर रहे हैं सुनिश्चित करें, ताकि के रूप में यकीन करने के लिए है कि एक प्रमोटर अन्य नहीं बाहर प्रतिस्पर्धा करेंगे.
Biolistic अभिकर्मक ऊतक रहने के उच्च वेग डीएनए लेपित सोने के कणों के साथ बमबारी के माध्यम से कोशिकाओं transfecting के एक भौतिक साधन है. कण मध्यस्थता जीन स्थानांतरण में, सामान्य ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में परिणाम जब बुलेट नाभिक में आराम आता है. जबकि कई अलग अलग अभिकर्मक तरीकों मौजूद हैं, microinjection, lipofection, कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक electroporation, और वायरल अभिकर्मक के रूप में, biolistic अभिकर्मक एक कम श्रम गहन, कोशिकाओं है कि आसानी से इन अन्य तरीकों का उपयोग नहीं ट्रांसफ़ेक्ट हैं transfecting के लिए और कुशल वैकल्पिक पेशकश कर सकते हैं. वास्तव में, यह पहली बार पौधों में जीन स्थानांतरण के लिए एक तकनीक के रूप में विकसित किया गया था के बाद सेल की दीवार की उपस्थिति अभिकर्मक मुश्किल preexisting 1 विधियों का उपयोग. इसी तरह, biolistics तंत्रिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में लोकप्रियता हासिल की है के बाद के बाद mitotic न्यूरॉन्स 2,3 transfect बेहद मुश्किल हैं . विशेष रूप में, यह व्यापक रूप से सिद्धांत तकनीक बरकरार मस्तिष्क स्लाइसें में एकल न्यूरॉन्स के ठीक आकारिकी का आकलन करने के उद्देश्य से प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा के रूप में मान्यता प्राप्त है. यहाँ वर्णित तरीकों कैसे सुसंस्कृत मस्तिष्क स्लाइसें के biolistic अभिकर्मक प्रदर्शन करने के लिए एक जीन बंदूक आयोजित हाथ (जीन Helios गन प्रणाली, जैव रेड) का उपयोग कर के एक विस्तृत और व्यापक विवरण प्रदान करते हैं.
Biolistic अभिकर्मक टुकड़ा संस्कृति में न्यूरॉन्स transfecting के लिए पसंदीदा तरीका बन गया है क्योंकि यह मस्तिष्क टुकड़ा भर में कोशिकाओं का एक विरल संख्या के अभिकर्मक की अनुमति देता है. इस तरह, व्यक्तिगत न्यूरॉन्स अलगाव में जांच की जा सकती है. के बाद से इस तकनीक का विशेष रूप से अच्छी तरह से मस्तिष्क टुकड़ा में न्यूरॉन्स transfecting के लिए अनुकूल है, यह अक्सर दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है fluorescently लेबल प्रकाश बिखरने 4 ऊतक के भीतर गहरे कोशिकाओं के 2- photon उत्तेजना सक्षम बनाता है दृश्य के बाद से. दरअसल इस वीडियो भर में एकल पिरामिड प्रस्तुत न्यूरॉन्स के उच्च बढ़ाई छवियों एक कस्टम बनाया लेजर 2-photon खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. निष्कर्ष biolistic अभिकर्मक में चारों ओर की कोशिकाओं के एक उच्च घनत्व के संदर्भ के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं transfecting का एक कारगर साधन है, और fluorescently neuronal टुकड़ा संस्कृति में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की लेबलिंग के लिए इस तरह के रूप में अत्यंत उपयोगी साबित हो गया है.
हम पूरे hippocampal इस वीडियो में प्रस्तुत स्लाइस की कम बढ़ाई छवियों को प्राप्त करने के साथ मदद के लिए मार्क Lucanic और चेंग Hwai - जोंग धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी करने के लिए वीडियो के साथ पाठ के साथ सहायता के लिए सारा Parrish धन्यवाद देना चाहूंगा.
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6um gold particles (microcarrier) | 0.25g | Bio-Rad | 1652264 | |
| 1M CaCl2 | Fluka | 21115 | ||
| 100% EtOH | 1pint | Goldshield | ||
| Cartridge Tubing | Bio-Rad | 1652412 | ||
| Scintillation vials | 20ml, 500/case | VWR international | 66021-668 | |
| Dessication pellets | Dricap | MTI (800-445-9890) | ||
| Water bath sonicator | model 50T | VWR international | ||
| Cartridge holder | pack of 5 | Bio-Rad | 1652426 | |
| Barrel liner | pack of 5 | Bio-Rad | 1652417 | |
| Diffuser screen | pack of 5 | Bio-Rad | 1652475 | |
| O-ring | 75 Viton, Size 007, Qty, 100 | McMaster-Carr | ||
| Screen (mesh) | McMaster-Carr | 144258 | ||
| PVP | 20mg/ml in EtOH | Bio-Rad | Comes with tubing from biorad | |
| Tubing prep station | Bio-Rad | 1652418 | ||
| Tubing cutter | Bio-Rad | 1652422 | ||
| Helios Gene-Gun | Bio-Rad | 1652411 | ||
| Gene gun hose | Bio-Rad | Comes with Gene-Gun | ||
| Spermidine | 5g | Sigma-Aldrich | s-0266 | |
| Although we have listed all the products seperately, it is more economical to purchase "Helios Gene-Gun System", which includes with all the products from Bio-Rad listed above (cat # 165-2431). | ||||
1. Klein, TM., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M. and Sanford, JC. Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).
2. Wellmann, H., Kaltschmidt, B. and Kaltschmidt, C. Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun. J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).
3. McAllister, AK. Biolistic transfection of neurons. Sci. STKE 51, 1-13 (2000).
4. Svoboda, K. and Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
Wow! This is a great article! A detailed visual and written protocol, superb. Congratulations to the authors and editors!
I have only one minor criticism: the use of "inches" (instead of centimeters).
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ReplyPosted by: AnonymousFebruary 15, 2008, 7:38 AM