JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE General

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You have trial access to videos in this collection until May 31, 2014.

Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

Beredning av Bullets Gene Gun och Biolistic transfektion av nervceller i Slice Kultur

1, 1

1Center for Neuroscience, University of California, Davis

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Vi beskriver en metod för att förbereda DNA-belagda guld kulor och demonstrera användningen av sådana kulor till biolistically transfektera nervceller i odlade hippocampus skivor.

    Date Published: 2/13/2008, Issue 12; doi: 10.3791/675

    Cite this Article

    Woods, G., Zito, K. Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture. J. Vis. Exp. (12), e675, doi:10.3791/675 (2008).

    Abstract

    Biolistic transfektion är en fysisk form av transfecting celler genom att bombardera vävnad med hög belagda hastighet DNA-partiklar. Vi erbjuder ett detaljerat protokoll för biolistic transfektion av råtta hippocampus skivor, från den ursprungliga beredningen av DNA-belagda kulor till den slutliga inspelningen av organotypic skiva kulturerna med en gen pistol. Gene pistol transfektion är ett effektivt och enkelt sätt att transfecting nervceller och är speciellt användbar för fluorescerande märkning en liten delmängd av celler i vävnaden skiva. I denna video, disposition vi först de åtgärder som krävs för att partiklar päls guld med DNA. Vi visar bredvid hur man klär insidan av plaströr med guld / DNA kulor, och hur man kan minska denna slang för att få plast patroner för påfyllning av genen pistol. Slutligen utför vi biolistic transfektion av råtta hippocampus skiva kulturer, visar hantering av Bio-Rad Helios genen pistol, och ge råd felsökning för att få friska och optimalt transfekterade vävnad skivor.

    Protocol

    PROTOKOLL FÖR BIOLISTIC transfektion

    Göra kulor

    Punkter är bra för upp till 6 månader, men kan börja minska i transfektion effektivitet efter 2-3 månader. Kulor ska förvaras vid 4 ° C i närvaro av torkmedel pellets. Låt alltid skintillationsflaskor, där kulor lagras, värmas upp till rumstemperatur innan du öppnar flaskan.

    Innan du börjar ha klart:

    • Spermidine (0,05)
    • CaCl 2 (1M)
    • EtOH (100%-högvärdigt-oöppnad flaska)
    • Autoklaveras H 2 0
    • DNA ska transfekterade
    • Polyvinylpyrrolidon (PVP-20 mg / ml lager)
    • 2 x 15 ml koniska (2/bullet set)
    • Slangar (skuren i 1 X ~ 30 inches / bullet set)
    • Skintillationsflaskor (1/bullet set)
    • Uttorkning pellets
    • 10 ml spruta w / slang på änden

    Förbered slang:

    1. Torr ~ 30 inches av slang (ca 2 inches längre än rätt O-ring) i slangen stationen W / N 2-gas (0,4 tryck) i minst 20 min.

    Utlösande DNA på guld pärlor:

    1. Förbered DNA ska transfekterade i 50 μmL totala volymen i mikrocentrifugrör (max 50 mikrogram totala DNA)
    2. Väg upp 6-8 mg guld och överföring till ett mikrocentrifugrör
    3. Tillsätt 100 mikroliter av 0,05 spermidine guld och Sonikera 20 sek
    4. Tillsätt 50 mikroliter av DNA till guld / spermidine
    5. Vortex (ca inställning 5) w / cap öppen
    6. Tillsätt droppvis 100 mikroliter 1 M CaCl 2
    7. Sonikera kort (<5 sek)
    8. Låt utfällning pågå i 10 minuter vid rumstemperatur
    9. Sonikera kort

    Förbered PVP lösning under sonication:

    1. Gör späda PVP-lösning i 15 ml koniska, 3.5ml späd PVP för varje uppsättning av kulor (lägg till 7,5 mikroliter av 20mg/ml PVP lager till 3,5 ml 100% EtOH)

    Sköljning guld pärlor med EtOH:

    1. Spinn ner guld pärlor i full fart i 10 sek i mikrocentrifug
    2. Kassera supernatanten, men behålla en liten mängd vätska på toppen av guld pärlor
    3. Tvätta 3X med 1 ml EtOH, låt ligga en kort stund varje gång om det behövs

    Resuspendera guld / DNA i PVP lösning:

    1. Resuspendera guld pelleten i 200 mikroliter av 3,5 ml utspädd PVP / EtOH lösning
    2. Vortex guldet pelleten resuspendera (kort Sonikera om nödvändigt)
    3. Överför 200 mikroliter av guld / PVP lösning på ett nytt 15 ml konisk
    4. Fortsätt på detta sätt lägga till 200 mikroliter av PVP i taget tills allt guld har överförts till de 15 ml koniska, och den slutliga volymen är 3,2 ml

    Beläggning slang:

    1. Stäng av N 2 i slangen stationen och ta bort torkade slangar
    2. Fäst torkade slangar till 10 ml sprutan
    3. Skaka 15 ml koniska fylld med guld / PVP
    4. Placera änden av slangen i guld / PVP lösning och suga upp långsamt noga med att undvika bubblor
    5. Lämna ~ 2 inches torra från båda ändarna av slangen
    6. Med slangen fortfarande sitter spruta och fylld med guld / PVP lösning, försiktigt placera slangen tillbaka till stationen
    7. Markera ändarna av slangen där lösningen sitter
    8. Låt det guld nöjer 5 min med sprutan fäst
    9. Sug upp lösningen mycket långsamt genom att dra i sprutan så att den fasta guld är kvar (se till att inte back-tvätt)
    10. Koppla sprutan
    11. Rotera 90 ° och låt sitta i 2 sekunder
    12. Rotera 180 ° och låt sitta ytterligare 2 sekunder
    13. Rotera röret i 5 sek
    14. Slå på N-2 så att ventilen läser på 0,4 - 0,5 och snurra på guld-belagda rör medan torkning i 5 min.

    Kapning slang:

    1. Ta bort slangen från slangen prep-stationen och klipp av ändarna på märken.
    2. Sätt en märkt scintillation flaska under slangen helikoptern för att fånga skära patroner
    3. Placera slangen i slangen helikoptern och skär slangen med rent rakblad
    4. Placera en uttorkning pellets i scintillations injektionsflaska
    5. Förvara patronerna vid 4 ° C

    Skytte Tissue Slices

    När du fotograferar odlade skivor, är det viktigt att anställa en relativt steril teknik för att undvika kontaminering. Kom ihåg, att när du fotograferar två olika konstruktioner, kan båda kulorna laddas in i samma patronhållaren, men fat-liner och skärmen ska bytas mellan konstruktioner.

    Innan du börjar ha klart:

    • DNA-kulor (låt scintillation injektionsflaska värmas upp till rumstemperatur innan den öppnas)
    • Tissue skivor
    • Helios Gene Gun
    • Helium tank med genen pistol slang fäst </ Li>
    • Patronhållaren
    • Barrel liner med plast O-ring på plats
    • Diffusor (modifierad)
    • Diffuser Skärm
    • Tång

    Prepping genen pistol:

    1. Använd pincett placera guld belagd plast patroner i patronhållaren.
    2. Placera filterhållaren i genen pistolen genom att först trycka tillbaka låset
    3. Säkra patronhållaren med lås
    4. Skaffa en tunna liner med en O-ring och spridaren skärmen säkert på plats
    5. Skruva fast fat-liner i genen pistol

    Fotografera odlade skivor med genen pistol:

    1. Sätt på hörselkåpor
    2. Anslut genen pistol i slang ansluten Helium bensintank
    3. Höj trycket på tanken till 180 PSI
    4. Skjut en tomt i luften för att avlägsna damm och skräp från spridaren skärmen. Att skjuta pistol, först tryck säkerheten förregling knappen tills pistolen piper, sedan trycka av.
    5. När du filmat det tomma, ta bort skivor från inkubatorn
    6. Advance pistol att först konstruera
    7. Skjut med diffusor skärmen ca 0,5 - 1 tum från segmentet
    8. Advance patronen mellan brunnar.
    9. När du filmat det sista väl, placera skivor tillbaka in i inkubatorn
    10. Stäng av gasen och släpper trycket Innan du tar bort pistolen från Helium slangen
    11. Skruva loss fat liner, och ta bort kassetten och använda skal

    Rengöringskassett ägare och trosskydd fat:

    1. Placera patroner, liners fat, och skärmar diffusor i en bägare med tvålvatten
    2. Placera bägaren i badet sonicator och Sonikera 20 min
    3. Skölj med vatten tills alla tvålrester avlägsnas
    4. Blötlägg i 70% EtOH i en timme
    5. Placera på torr pappershandduk över natten för att torka
    6. Rengör bläckpatroner, liners fat, och skärmar kan sedan återanvändas i senare biolistic transfections

    Felsökning tips för Biolistic Transfektion

    Biolistic transfektion kan ibland resultera i suboptimalt transfektion förhållanden. Det kan leda till för få eller för många celler transfekterade, för högt eller för lågt uttryck eller kan orsaka vävnad skivor bli allmänt ohälsosamt. Ofta ohälsosamma skivor resultat från trycket explosionen. Här är några tips för att få optimalt transfekterade vävnad skivor.

    Om skivor verkar vara ohälsosam (eller om alltför många celler transfekterade / skiva), försök:

    • ökar fotograferingsavstånd
    • minskar trycket på bensintank
    • minska mängden guld
    • klippa ut i mitten av Bio-Rad diffusor och ersätta centrum med en diffusor skärm.

    Om för få celler transfekterade, försök:

    • minskar fotograferingsavstånd
    • ökande trycket på bensintank
    • att öka mängden guld
    • öka antalet vävnaden skivor / brunn
    • Se till att O-ringen i tunnan-liner är intakt.

    Om du får skivor med både för många och för få celler transfekterade under samma skytte se:

    • att du håller pistolen symmetriskt placerad ovanför väl
    • att guld är jämnt beläggning på insidan av slangen. (Om du får en linje av guld, dra ut supernatant från slangen i en snabbare takt efter att guldet har lagt sig och rotera guldet längre innan du sätter på kväve. Om, å andra sidan, får ni strimmor av guld Detta beror troligen på för mycket fukt exponering under bullet göra: Se till att du använder en oöppnad flaska EtOH, att slangen är ordentligt torr innan beläggningen, och att du tak lock och förbereder kulor i rätt tid).

    Om transfektion effektivitet verkar optimal (# celler transfekterade / skiva), men uttrycket nivån verkar för hög eller för låg:

    • anpassa förhållandet DNA till guld. (T.ex. om det är för lågt behålla mängden guld, men öka mängden DNA.)
    • justera tiden mellan fotografering och datainsamling

    Vid dubbla transfektion, om du får för lite uttryck för en av dina konstruktioner, justera förhållandet mellan de två konstruktioner på ett lämpligt sätt och se till att båda konstruktioner är under samma promotorn, så se till att en promotor kommer inte konkurrera ut den andra.

    Discussion

    Biolistic transfektion är en fysisk form av transfecting cellerna via bombardemang av levande vävnad med hög belagda hastighet DNA-guld partiklar. I partikel medierad genöverföring i allmänhet transfekterade celler resultat när kulan stannar i cellkärnan. Medan många olika transfektion metoder finns, såsom mikroinjektion, lipofection, kalcium-fosfat transfektion, elektroporation och virala transfektion, kan biolistic transfektion erbjuda en mindre arbetsintensiv och effektiva alternativ för transfecting celler som inte är lätt transfekterade med hjälp av dessa andra metoder. I själva verket var det först utvecklades som en teknik för genöverföring i växter eftersom närvaro av cellväggen gjorde transfektion svårt att använda redan existerande metoder 1. Likaså har biolistics vunnit popularitet inom neurobiologi sedan efter mitotiska nervceller är notoriskt svåra att transfektera 2,3. Framför allt är det allmänt erkänt som den princip som skall användas i experiment för att bedöma fina morfologi hos enskilda nervceller i hjärnan intakt skivor. De metoder som beskrivs här ger en detaljerad och omfattande beskrivning av hur man utför biolistic transfektion av odlade hjärnan skivor med hjälp av en handhållen gen-gun (Helios Gene Gun systemet, Bio-Rad).

    Biolistic transfektion har blivit den bästa metoden för transfecting nervceller i slice kulturen eftersom den tillåter transfektion av en gles antal celler i hela hjärnan slice. På detta sätt kan enskilda nervceller granskas isolerat. Eftersom den här tekniken är särskilt väl lämpad för transfecting nervceller i hjärnan skiva, är det ofta används i samband med 2-foton mikroskopi, eftersom 2-photon excitation möjliggör visualisering av fluorescerande celler djupt inom ljusspridning vävnad 4. Faktum är att hög förstoring bilder av enstaka pyramidal nervceller som presenteras i den här videon fångades med hjälp av en specialbyggd 2-foton laserskanning mikroskop. Sammanfattningsvis biolistic transfektion är ett effektivt sätt att transfecting enskilda celler i samband med en hög täthet av omgivande celler, och som sådan har visat sig extremt användbart för fluorescerande märkning enskilda nervceller i neuronala bit kultur.

    Disclosures

    Acknowledgements

    Vi vill tacka Mark Lucanic och Hwai-Jong Cheng för hjälp med att skaffa den låga förstoringen bilder av hela hippocampus skivor som presenteras i denna video. Vi vill också tacka Sarah Parrish för att hjälpa med texten medföljer videon.

    Materials

    Name Type Company Catalog Number Comments
    1.6um gold particles (microcarrier) 0.25g Bio-Rad 1652264
    1M CaCl2 Fluka 21115
    100% EtOH 1pint Goldshield
    Cartridge Tubing Bio-Rad 1652412
    Scintillation vials 20ml, 500/case VWR international 66021-668
    Dessication pellets ”Dricap” MTI (800-445-9890)
    Water bath sonicator model 50T VWR international
    Cartridge holder pack of 5 Bio-Rad 1652426
    Barrel liner pack of 5 Bio-Rad 1652417
    Diffuser screen pack of 5 Bio-Rad 1652475
    O-ring 75 Viton, Size 007, Qty, 100 McMaster-Carr
    Screen (mesh) McMaster-Carr 144258
    PVP 20mg/ml in EtOH Bio-Rad Comes with tubing from biorad
    Tubing prep station Bio-Rad 1652418
    Tubing cutter Bio-Rad 1652422
    Helios Gene-Gun Bio-Rad 1652411
    Gene gun hose Bio-Rad Comes with Gene-Gun
    Spermidine 5g Sigma-Aldrich s-0266
    Although we have listed all the products seperately, it is more economical to purchase "Helios Gene-Gun System", which includes with all the products from Bio-Rad listed above (cat # 165-2431).

    References

    1. Klein, TM., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M. and Sanford, JC. Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).

    2. Wellmann, H., Kaltschmidt, B. and Kaltschmidt, C. Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun. J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).

    3. McAllister, AK. Biolistic transfection of neurons. Sci. STKE 51, 1-13 (2000).

    4. Svoboda, K. and Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).

    Comments

    19 Comments

    Wow! This is a great article! A detailed visual and written protocol, superb. Congratulations to the authors and editors!I have only one minor criticism: the use of "inches" (instead of centimeters).
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 15, 2008, 7:38 AM

    Do you routinely have problems with humidity in the lab environment?  I work down at UTMB in Galveston, TX and we were told that it would be difficult to make the bullets because of our high relative humidity.  Your article is great, very concise and easy to follow, and it seems like you don't worry about relative humidity at all.Thanks for any help you can give!
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 21, 2008, 3:46 PM

    It is relatively dry in Davis (~²0% humidity), so yes: we do not worry about humidity. But Dr. Zito used to make bullets back at Cold Spring Harbor in the thick of humid New York summers and never had any problems. If you dry your tubing thoroughly (~30 min) with nitrogen and use a newly unopened bottle of EtOH every time I imagine that you should be fine.-Georgia
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 22, 2008, 2:29 PM

     First of all, I must credit the authors and video team for an extremely well written protocol.   I have been struggling to get a complete picture of biolistic tranformation and this video entry very effectively demonstrates the use of the Bio-Rad Gene Gun. I am in the process of developing a biolistic method for the transformation of bacterial cell cultures.  Since biolistics is not very often utilized for bacterial transformation even the technical reps over at Bio-Rad knew little about the details.  Do the authors or anybody else know others that have worked with transforming bacterial cell lines using the Gene Gun?  If so, I would appreciate any references for these methods.I am aware that their is a secodary biolistic system available through Bio-Rad called the method using a Biolistic® PDS-1000/He
    Particle Delivery System
    .  This system consists of a pressurized chamber component - as opposed to the Gene Gun - for particle delivery.  It is my understanding that this system is better for bacterial transformation.  However, I have come across a loaner Gene Gun system (not the PDS-1000) and would like to attempt bacterial transformation with this. Any help will be appreciated.      
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 28, 2008, 2:20 PM

    Hi Trook, I'm interested to know if you succeeded in transforming bacteria with the gene gun?
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 3, 2011, 2:46 AM

    This is a wounderful video on use of gene gun. I would like to download this video, how could i should do this.  i am starting to apply this technique in studying ion channels.  could you please let me know the way of downloading this clip. Thanking you Sincerely Nagesh. M  
    Reply

    Posted by: AnonymousMay 16, 2008, 3:04 PM

    Greetings Nagesh!  Good to hear you want to put biolistic transfection to such noble use!  I spent my graduate career as a channelologist.  Please contact me directly and I will set you up with a way to access this video for download. AaronK@JoVE.com  
    Reply

    Posted by: Aaron K.May 16, 2008, 6:20 PM

    I had never done this protocol before, and using this technique has been HUGELY helpful.  It it an easy to use protocol, well written, and the video showing the steps have been so easy to follow. Thanks so much, with this protocol I am already becoming quite proficient, and my boss is thrilled with me.
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 2, 2008, 10:39 AM

    why do you use gold particles instead of tugstene particles?
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 18, 2008, 8:00 PM

    It turns out that tungsten can be toxic to cells, and catalytically
    degrades DNA.(Sanford et al. 1993). Hope that helps.
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 21, 2008, 12:49 PM

    Thank you very much for making this video! Very precise and easy to follow. This really helps my experiment.
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 29, 2008, 3:48 PM

    Hi...
    This protocol was very useful and I agree with all the positive comments posted above! I am using it to transect hippocampal brain slices.
    I have a question about the distribution of the bullets into the slices. Although, I am following this protocol, I am not able to achieve optimal transfection efficiency. Also, the distribution of the transfected cells throughout the slice dŒs not remain uniform. I have tried using the mesh suggested in this protocol and that too dŒs not make much difference; While In the images displayed in this protocol I could see very well uniformly transfected cells throughout the slice. Can you give any suggestions to improve uniformity in distribution of transfected cells?
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 14, 2010, 5:04 PM

    Hi Shruti,
    I can think of two likely possibilities:
    (1) the gold in the bullets is not evenly distributed -- try to make sure that it dŒs not end up all on one side
    (²) you are shooting too close to your samples-- try backing up a bit
    Best of luck!
    Reply

    Posted by: Karen Z.July 27, 2010, 12:15 PM

    how can i download the video?.
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 18, 2011, 6:54 AM

    It is not possible to download any of our video articles. This particular article is free to view so you can enjoy it many times over.

    Best,
    JoVE
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 18, 2011, 11:59 AM

    Hi, I was wondering if it is possible to stain the tissues with other antibodies either before or after labeling with the gene gun. I usually label brain slices with DiI using the gene gun but I also want to look at some other proteins and I was thinking of using the same slices for IHC as well if possible?
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 26, 2012, 5:18 PM

    Hi Harpreet,
    We have never done this but I don't see why not... try it?
    Best of luck!
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 29, 2012, 8:03 PM

    Dear Dr. Woods,

    First, I wanted to thank you for this video. It allows to show very clearly all stages of the biolistic transfection protocol.

    I would like to try your modified diffusion screen but the catalog number 144²58 is unobtainable.

    I would be very grateful if you could maybe give me the characteristics of your screen mesh please?

    I am looking forward to hearing from you.

    Best regards,

    Paula
    Reply

    Posted by: Paula P.July 6, 2012, 5:55 AM

    Hi Paula- sorry for the delay. The mesh can be obtained from McMaster-Carr - item number 9317T109 - http://www.mcmaster.com/#catalog/118/41²/=iirztc - Corrosion-Resistant 304 SS Wire Cloth Disc 100 X 100 Mesh, 1-1/4" Diameter, .0045" Wire Dia - let me know if you have any problems and good luck!
    Reply

    Posted by: Karen Z.July 22, 2012, 5:43 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter