Preparazione di proiettili pistola Gene e Biolistic Transfection dei neuroni in cultura Slice

Woods, G., Zito, K. Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture. J. Vis. Exp. (12), e675, doi:10.3791/675 (2008).

PROTOCOLLO per la trasfezione BIOLISTIC

Nella produzione di proiettili

Proiettili sono buoni per un massimo di 6 mesi, ma potrebbe cominciare a diminuire in termini di efficienza di trasfezione dopo 2-3 mesi. Proiettili deve essere conservato a 4 ° C in presenza di pellet essiccante. Sempre lasciato le fiale di scintillazione, in cui sono memorizzati proiettili, a temperatura ambiente prima di aprire il flacone.

Prima di iniziare sono pronti:

• Spermidina (0,05 m)
• CaCl ₂ (1M)
• EtOH (100% di alta qualità, non aperto bottiglia)
• Autoclavato H ₂ 0
• Di DNA da transfettate
• Polivinilpirrolidone (PVP-20 mg / ml di brodo)
• 2 x 15 ml coniche (2/bullet set)
• Tubi (tagliato in 1 X ~ 30 pollici / set proiettile)
• Fiale di scintillazione (set 1/bullet)
• Essiccazione pellet
• Siringa da 10 ml w / tubazioni alla fine

Preparare tubi:

1. Secco ~ 30 pollici di tubo (circa 2 pollici si estende oltre a destra O-ring) nella stazione di tubo w / N ₂ gas (0,4 pressione) per un minimo di 20 min.

Precipitare il DNA perline d'oro:

1. Preparare DNA da transfettate in 50 volumi μmL totale in provetta (massimo DNA 50 mg in totale)
2. Pesare 6-8 mg di oro e di trasferimento in un tubo da microcentrifuga
3. Aggiungere 100 ml di spermidina 0,05 m a oro e ultrasuoni per 20 secondi
4. Aggiungere i 50 ml di DNA per l'oro / spermidine
5. Vortex (circa impostazione 5) w / cappello aperto
6. Aggiungere goccia a goccia 100 l di CaCl ₂ 1M
7. Sonicare brevemente (<5 sec)
8. Lasciar decantare per 10 minuti a temperatura ambiente
9. Sonicare brevemente

Preparare la soluzione PVP durante la sonicazione:

1. Fai la soluzione diluita di PVP in 15 ml, 3,5 ml diluire PVP per ogni set di proiettili (aggiungere 7,5 l di magazzino 20mg/ml PVP al 3,5 ml di EtOH 100%)

Risciacquo perline oro con EtOH:

1. Spin down perle d'oro alla massima velocità per 10 secondi in microcentrifuga
2. Gettare il surnatante, ma tenere una piccola quantità di liquido sulla parte superiore di perline oro
3. Lavare 3 volte con 1 ml di EtOH, ultrasuoni per un breve istante, se necessario

Risospendere oro / DNA in soluzione PVP:

1. Risospendere il pellet oro in 200 ml di ml 3,5 diluire PVP / EtOH soluzione
2. Vortex il pellet oro per sospendere di nuovo (brevemente sonicare se necessario)
3. Trasferire i 200 ml di oro / PVP soluzione ad un nuovo 15 ml conica
4. Continuare in questo modo, aggiungendo 200 ml di PVP alla volta fino a tutto l'oro è stato trasferito il 15 ml conica, e il volume finale è di 3,2 ml

Rivestimento tubi:

1. Spegnere N ₂ alla stazione di tubi e rimuovere tubi secca
2. Collegare il tubo secca alla siringa da 10 ml
3. Agitare vigorosamente i 15 ml conica riempita d'oro / PVP
4. Posizionare l'estremità del tubo in oro / soluzione di PVP e succhiare lentamente, facendo attenzione ad evitare le bolle
5. Lascia ~ 2 pollici a secco da entrambe le estremità del tubo
6. Con il tubo ancora attaccato alla siringa e riempite con la soluzione d'oro / PVP, posizionare con attenzione il retro tubo nella stazione
7. Segnare le estremità del tubo in cui la soluzione si trova
8. Lasciate che l'oro accontentarsi di 5 minuti con la siringa collegata
9. Succhiare-la soluzione molto lentamente tirando la siringa in modo che l'oro si stabilirono è lasciato alle spalle (non sono sicuro di fare back-wash)
10. Staccare la siringa
11. Ruota di 90 ° e lasciate riposare 2 secondi
12. Ruotare di 180 ° e lasciate riposare altri 2 secondi
13. Ruotare la provetta per 5 sec
14. Accendere la N ₂ in modo che la valvola si legge tra 0,4 - 0,5 e girare l'oro rivestite tubi durante l'asciugatura per 5 min.

Taglio tubi:

1. Rimuovere il tubo dal tubo preparazione-stazione e tagliare le estremità a marchi.
2. Metti una fiala di scintillazione etichettati con l'elicottero tubi per prendere le cartucce taglio
3. Tubo posto nel tubo di chopper e tagliare il tubo con il rasoio pulito
4. Posizionare un pellet essiccazione in flaconcino scintillazione
5. Conservare le cartucce a 4 ° C

Shooting fette di tessuto

Quando si riprende fette colto, è importante utilizzare una tecnica relativamente sterile per evitare contaminazioni. Ricordate che quando si scatta due costrutti differenti, entrambe le serie di proiettili che possono essere caricati nel supporto della cartuccia stessa, ma la canna-liner e lo schermo dovrebbe essere cambiato tra i costrutti.

Prima di iniziare sono pronti:

• Proiettili del DNA (per non fiala di scintillazione a temperatura ambiente prima di aprire)
• Fette di tessuto
• Helios Gun Gene
• Serbatoio di elio con tubo gene pistola allegato </ Li>
• Cartuccia titolare
• Botte con fodera in plastica O-ring in posizione
• Diffusore (modificato)
• Diffusore schermo
• Forcipe

Preparando la pistola gene:

1. Forcipe utilizzando posto delle cartucce di plastica rivestiti in oro il supporto della cartuccia.
2. Posizionare il supporto della cartuccia nella pistola gene dapprima spingendo indietro blocco
3. Fissare il supporto della cartuccia con serratura
4. Ottenere un rivestimento a botte con un O-ring e lo schermo diffusore saldamente in posizione
5. Avvitare la canna-liner nella pistola gene

Shooting fette di coltura con la pistola del gene:

1. Indossare cuffie
2. Collegare la pistola gene in tubo collegato serbatoio del gas elio
3. Alzare la pressione sul serbatoio a 180 PSI
4. Spara un vuoto in aria al fine di rimuovere ogni traccia di polvere o detriti dallo schermo diffusore. Per sparare la pistola, prima premere il pulsante di blocco di sicurezza fino a quando il bip pistola, poi premere il grilletto.
5. Dopo lo scatto in bianco, togliere le fette dalla incubatore
6. Anticipo pistola a costruire prima
7. Spara con lo schermo diffusore di circa 0,5 - 1 pollice dalla fetta
8. Anticipo la cartuccia tra i pozzi.
9. Dopo aver sparato il bene ultimo, disporre le fette di nuovo nel incubatore
10. Spegnere la pressione del gas e rilasciare prima di staccare la pistola dal tubo di elio
11. Svitare il rivestimento barile, e rimuovere la cartuccia e le conchiglie utilizzate

Pulizia titolari cartuccia e rivestimenti barile:

1. Cartucce luogo, rivestimenti barile, e gli schermi diffusore in un bicchiere con acqua e sapone
2. Bicchiere posto in bagno sonicatore e ultrasuoni per 20 minuti
3. Sciacquare con acqua fino a quando tutti i residui di sapone vengono rimossi
4. Mettere a bagno in 70% EtOH per un'ora
5. Mettere su carta assorbente per asciugare asciugare durante la notte
6. Pulire le cartucce, rivestimenti barile, e gli schermi possono essere riutilizzati nei successivi trasfezioni biolistic

Riprese suggerimenti guai per Transfection Biolistic

Trasfezione Biolistic a volte può risultare in condizioni non ottimali di trasfezione. Può portare a troppo pochi o troppo molte cellule transfettate, troppo alti o troppo bassi livelli di espressione, o può causare fette di tessuto a diventare generalmente malsano. Spesso il risultato malsano fette dall'esplosione di pressione. Ecco alcuni consigli per ottenere fette di tessuto in modo ottimale transfettate.

Se le fette sembrano essere malsana (o se troppe cellule sono transfettate / fetta), prova:

• all'aumentare della distanza di tiro
• diminuzione di pressione sul serbatoio del gas
• diminuendo la quantità di oro
• tagliare fuori il centro della Bio-Rad diffusore e sostituire il centro con uno schermo diffusore.

Se le cellule sono troppo pochi transfettate, prova:

• diminuzione distanza di ripresa
• crescente pressione sul serbatoio del gas
• aumentare la quantità di oro
• aumentando il numero di fette di tessuto / e
• assicurarsi che l'O-ring nella canna-liner è intatto.

Se si ottengono fette con entrambe le celle troppi e troppo pochi transfettate durante le riprese stesse accertarsi che:

• che si sta tenendo la pistola simmetricamente sopra e
• che l'oro è uniforme rivestimento all'interno del tubo. (Se hai trovato una linea d'oro, tirare fuori il surnatante dal tubo ad una velocità maggiore una volta che l'oro si è stabilito e ruotare l'oro più a lungo prima di accendere l'azoto. Se, invece, hai trovato striature d'oro , questo è probabilmente dovuto all'esposizione troppa umidità durante rendendo proiettile: assicurarsi che si sta utilizzando una bottiglia chiusa di EtOH, che il tubo sia completamente asciutto prima di rivestimento, e che si tappatura coperchi e la preparazione di proiettili in un modo attuale).

Se l'efficienza di trasfezione sembra ottimale (# cellule transfettate / fetta), ma il livello di espressione sembra troppo alta o troppo bassa:

• regolare il rapporto di DNA in oro. (Ad esempio, se è troppo basso mantenere la quantità di oro, ma aumentare la quantità di DNA.)
• regolare la quantità di tempo tra le riprese e la raccolta dati

Nel caso di transfezione doppio, se hai trovato espressione troppo poco di uno dei tuoi costrutti, regolare il rapporto tra i due costrutti in modo appropriato e fare in modo che entrambi i costrutti sono sotto il promotore stesso, in modo da assicurarsi che uno promotore non entrare in competizione l'altro.

Transfezione Biolistic è un mezzo fisico di trasfezione delle cellule tramite bombardamento di tessuto vivente ad alta velocità con particelle d'oro rivestiti di DNA. Nel trasferimento di geni mediato delle particelle, in genere cellule transfettate risultato quando il proiettile si ferma nel nucleo. Mentre molti metodi di trasfezione diverse esistono, come la microiniezione, lipofection, calcio-fosfato trasfezione, elettroporazione e trasfezione virale, trasfezione biolistic in grado di offrire un lavoro meno intenso, ed efficiente alternativa per trasfezione delle cellule che non sono facilmente transfettate con questi altri metodi. Infatti, è stato sviluppato come una tecnica di trasferimento genico nelle piante in quanto la presenza della parete cellulare reso difficile trasfezione con metodi preesistenti ^1. Allo stesso modo, biolistics ha guadagnato popolarità nel campo della neurobiologia dall'ultimo post-mitotico neuroni sono notoriamente difficili da ^2,3 trasfezione. In particolare, è ampiamente riconosciuto come la tecnica del principio da utilizzare in esperimenti volti a valutare la morfologia multa di singoli neuroni in fettine di cervello intatto. I metodi descritti qui fornisce una spiegazione dettagliata e completa di come eseguire trasfezione biolistic di fette di cervello colto con una mano tesa gene-gun (Gun sistema Helios Gene; Bio-Rad).

Trasfezione Biolistic è diventato il metodo preferito per la trasfezione neuroni in cultura fetta perché permette trasfezione di un certo numero di cellule sparse per tutta la fetta cervello. In questo modo, i singoli neuroni possono essere esaminate in modo isolato. Poiché questa tecnica è particolarmente adatto per trasfezione neuroni nel cervello fetta, è spesso utilizzato in combinazione con 2-fotone microscopia, dal momento che 2-fotone eccitazione permette la visualizzazione di cellule marcate in profondità all'interno dei tessuti dispersione della luce ^4. Infatti le immagini ad alto ingrandimento dei singoli neuroni piramidali presentato in tutto il video sono stati catturati usando un custom 2-fotone microscopio a scansione laser. In conclusione la transfezione biolistic è un mezzo efficace di trasfezione delle singole cellule nel contesto di una alta densità di cellule circostanti, e come tale si è dimostrato estremamente utile per l'etichettatura fluorescente singoli neuroni in coltura fetta neuronale.

Vorremmo ringraziare Mark Lucanic e Hwai-Jong Cheng aiuto per acquisire le immagini a basso ingrandimento di intere fette di ippocampo presentati in questo video. Vorremmo anche ringraziare Sarah Parrish per aver aiutato con il testo che accompagna il video.

1. Klein, TM., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M. and Sanford, JC. Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).

2. Wellmann, H., Kaltschmidt, B. and Kaltschmidt, C. Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun. J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).

3. McAllister, AK. Biolistic transfection of neurons. Sci. STKE 51, 1-13 (2000).

4. Svoboda, K. and Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).

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