In Vivo 2-Photon Kalcium Imaging i Layer 2 / 3 av Möss

1. Förbered fluorescerande lösningen kalcium indikator. Vi använder acetoximetyl ester färgämnen eller AM färgämnen för korta. Dessa är färgämnen som kan tas upp av celler när det injiceras extracellularly. Vi använder vanligtvis Oregon-Grön BAPTA-1 AM eller Fluo-4 ÄR vid en koncentration av 1 mm. AM färgämnen kan erhållas från Invitrogen i 50 mikrogram flaskor. Vi förbereder först en 20% lösning av Pluronic F-127 i DMSO. Vi varma lösningen före användning varje dag tills dess klara. Vi löser upp kalcium indikator på 20% Pluronic F-127/DMSO i 15-20 minuter till en koncentration på 10 mm. Vi Späd sedan lösningen till 1 mm i en lösning som innehåller, i mm: 150 NaCl, 2,5 KCl, 10 Hepes, pH 7,4. Dessutom är 100 mikroM Sulforhodamine 101 vanligtvis ingår att märka astrocyter och visualisera pipetten under injektionen. Vi filtrera lösningen innan injektion med en 0,49 mikron centrifugal-filter (Stosiek et al, 2003;.. Garaschuk et al, 2006).
   
   
2. Implantat en kraniell fönster över det område som ska avbildas. Vi har beskrivit de allmänna riktlinjerna från JUPITER , men med följande ändringar är viktiga för kalcium färg injektion:
   
   Gör en mindre kraniotomi 2 mm i diameter över kortikala område av intresse med extrem försiktighet att inte skada den underliggande dura. Säkra ett täckglas på plats över kraniotomi, men bara delvis täcker kraniotomi och lämnar ett litet mellanrum mellan kanten på kraniotomi och glaset täckglas för att ge plats för en pipett att komma in i hjärnbarken snett. Före injektion, gör ett grunt bra med dentala cement runt kraniotomi. Den väl bör utvidga som rostralt i riktning och vara grunt nog att tillåta införandet av mikropipett för injektion.
   
   
3. Överför musen över till det stadium i mikroskop och immobilisera huvudet, som visas i vår video på blodflödet avbildning .
   
   
4. Dra pipetter glas mikroelektrod till en spets diameter ger 2-4 Mega Ohm i motstånd med hjälp av en pipett avdragare. Ladda kalcium blandningen indikatorn färg på glaspipett hjälp av mikrospruta. Med hjälp av en mikromanipulator försiktigt sänka mikropipett på ytan av hjärnan med hjälp av en 4X mål, som sedan fint placerad under en 40X mål. Välj en lämplig plats för injektion, så att det finns få eller inga överliggande blodkärlen att skymma avbildning. Med hjälp av två-photon mikroskopi, är spetsen på pipetten visualiseras och avancerade långsamt i hjärnbarken, till ett djup av 200 mikrometer under dura. Då trycket injicera färgämne blandningen vid 10 PSI i 1 minut med hjälp av en Picospritzer. Vi levererar vanligtvis två till fyra injektioner av AM kalcium färg blanda, separerade i rymden med cirka 200-300 mikrometer. Denna delen lastning tillvägagångssätt något överlappande injektioner garanterar att en yta lika stor som 600 x 600 mikrometer tillräckligt färgas för kalcium avbildning. Börja avbildning 1 timme efter injektion av AM färg blandningen, för att möjliggöra färgen att sprida och tas upp av nervceller.
   
   
5. Utför in-vivo två-photon avbildning med en skräddarsydd två-photon mikroskop med hjälp av en kameleont Ti-Sapphire Laser (inställd på 800-880 nm) och Cambridge Technology speglar galvanometer. Vi förvärvar bilder med ScanImage Programvara som utvecklats i Karel Svoboda laboratorium (Pologruto et al., 2003). Laser Power är normalt en bra bit under 70 mW vid provet. Hela fältet bilder förvärvas antingen med en 20X (0,95 NA) eller 40X (0,8 NA) Olympus mål på 1,95 till 15,63 bilder per sekund (512 x 256 pixlar till 256 x 64 pixlar). Linje skannar förvärvas vid 500 Hz. Vid avbildning, är djur som hålls i ljus isoflurananestesi (0,6-0,9%), och är också hållits vid 37 ° C med en Harvard Apparatur enhet temperaturreglering. Man ser till att hålla andningsfrekvensen av djur så nära 100 andetag / minut som möjligt. Denna nivå av anestesi användning är den lägsta nivå som immobilizes djuret, men ändå tillåter spontan verksamhet som ska registreras.

Fördelen med denna metod under elektrofysiologiska inspelningar är att det är mindre invasiv och gör inspelningarna av aktivitet i tät neuronala neuronala nätverk. När du gör detta förfarande det är viktigt att komma ihåg att största försiktighet när du utför kraniotomi inte skada dura. Även en liten mängd subdural blödning med obskyra kraftigt avbildning.