وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

توسيم الخلايا الجذعية الوسيطة مع صبغة الفلورسنت هل

1. لبدء إجراءات لوضع العلامات الخلايا الجذعية الوسيطة ، ويعرض للتريبسين عدد الخلايا للحصول على تعليق مع عدد محدد من الخلايا.
2. تأخذ الخلايا من الحاضنة ونضح من وسائل الإعلام القديمة من القوارير التي تحتوي على خلايا يمكن وصفها
3. غسل الخلايا مع 10 مل من مغ / كا خالية من برنامج تلفزيوني. نضح بها في برنامج تلفزيوني. فإن المغنيسيوم والكالسيوم وتمنع التربسين ، وبالتالي فإننا نستخدم برنامج تلفزيوني من دون هذه.
4. إضافة قبل التربسين تحسنت 0.05 ٪ ، وذلك لأننا نستخدم قارورة T75 5ml. ضمان أن يتم تغطية كامل سطح القارورة.
5. احتضان عند 37 درجة مئوية في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
6. تأكيد انفصال تحت المجهر. إذا كانت الخلايا لا تزال تلتزم القارورة ، اضغط عليها عدة مرات والانتظار لفترة أطول قليلا حتى trypsinization الناجحة.
7. الآن ، فإنه من الضروري تحييد التربسين بإضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على 10 ٪ FCS. نستخدم مبلغ مساو من وسائل الاعلام كما يوجد التربسين.
8. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لضمان كافة الخلايا إعادة معلقة في وسائل الإعلام.
9. نقل الخلية إلى حل عقيم 15ml الانبوب البولي بروبلين توج.
10. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5 دقائق.
11. نضح خارج طاف ضمان عدم تعكير صفو بيليه الخلية.
12. Resuspend الخلايا في DMEM والمضي قدما في عدد الخلايا.
13. تعليق الخلايا ليكون المسمى في كثافة 1x10 ^ 6 في مل في مستنبت المصل الحرة (DMEM).
14. وكان كل هذا التحضير لتعليق الخلية. الآن ، وانها مستعدة لبدء وضع العلامات.
15. الأولى ، إضافة 5 ميكرولتر من عامل تباين هل مل من التعليق في الخلية.
16. ثم ، مزيج الحل بواسطة pipetting بلطف.
17. احتضان الخلايا مع الحل وضع العلامات عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في طبق المنخفضة المرفق 6 أيضا.
18. بمجرد اكتمال حضانة بسيطة ، فمن الضروري لنقل الخلية إلى حل أنبوب 15 مل توج البولي بروبلين.
19. أجهزة الطرد المركزي لأسفل في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5 دقائق.
20. نضح بها الوسم المتوسط ​​، وضمان عدم تعكير الخلية بيليه.
21. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. ماصة الخلايا صعودا وهبوطا ، والتأكد من لتفريق بيليه الخلية.
22. كرر الخطوتين الأخيرتين أكثر من مرة ، حتى لا يكون هناك ما مجموعه 3 خطوات الغسيل.
23. عدد الخلايا وإجراء اختبار لتحديد التريبان الأزرق بقاء الخلية. هذه الثقافة هي المعيار بروتوكولات الخلية أننا لن أشرح هنا.
24. الخلايا الخاصة بك الآن على استعداد ليمكن تصوير في تصوير الضوئي.

توسيم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مع ICG صبغة الفلورسنت

1. لبدء إجراءات لوضع العلامات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، وإعداد وكيل النقيض من خضرة الإندوسيانين. مزجها مع ترنسفكأيشن بروتامين الوكيل.
2. قياس خارج 1mg من المسحوق خضرة الإندوسيانين. حل مسحوق ICG في 100 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
3. إضافة 400 ميكرولتر من النسور Dulbecco ومتوسطة التعديل (العجل الجنين DMEM + 10 ٪ المصل) وسائل الإعلام إلى الخليط ويهز جيدا. هذه النتائج في التركيز النهائي لل2mg/ml من خضرة الإندوسيانين.
4. إضافة بروتامين كيل ترنسفكأيشن. بروتامين الأفعال باعتبارها وكيلا للمكوك النقيض من ذلك ، بحيث يحصل داخل الخلية بشكل أكثر كفاءة.
5. مزيج 5 سلفات بروتامين ميكرولتر ، والتي يتم توفيرها في تركيز 10mg/ml ، مع 300 و 300 ميكرولتر ICG ميكرولتر المصل الحرة Dulbecco ومتوسطة النسور التعديل.
6. يهز بلطف الحل ترنسفكأيشن جديدة لمدة 5 دقائق للسماح معقدة لتشكيل.
7. الحل هو وضع العلامات جاهزة.
8. نضح من وسائل الإعلام القديمة من طبق بيتري hESC 10MM.
9. إضافة 5ml من المصل DMEM خالية قبل تحسنت.
10. إضافة الحل أعدت مسبقا بروتامين / ICG إلى الخلايا. بدء الحضانة 1 ساعة عن طريق وضع الطبق في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
11. بعد اكتمال الحضانة ، وإزالة الطبق من الحاضنة ونضح من الحل التوسيم.
12. غسل الخلايا وذلك بدهن الطبق مع PBS 5 مل.
13. نضح بها في برنامج تلفزيوني واستبدال التربسين 5ml من 0.25 ٪. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح trypsinization تحدث. فهو يساعد على التخلص الطبق قليلا في كل مرة واحدة في حين لاخر.
14. ماصة بلطف صعودا ونزولا ، لتفريق المستعمرات المتبقية.
15. تحييد التربسين بإضافة مبلغ مساو من KSR إلى الطبق.
16. نقل الخلية إلى حل 15ml أنبوب الطرد المركزي والحل في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5 دقائق.
17. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام الكاملة.
18. إذا كان لا يزال هناك كتل عند هذه النقطة ، ويعرض للتريبسين الطرد المركزي مرة أخرى.
19. حالما يتم التوصل إلى حل أجمة خالية من الخلية ، ونضح من وسائل الإعلام القديمة وresuspend لبيليه في 10ML من قبل وسائل الإعلام تحسنت ESC الكامل.
20. عند هذه النقطة ، فمن الضروري فصل الخلايا المغذية الماوس من hESCs. يتم ذلك لضمان أنه في وقت لاحق ، فقط تصوير الخلايا الجذعية يحدث.
21. لهذا ، ونقل عشرةه حل خلية إلى الجيلاتين المغلفة طبق 10 سم.
22. وضع الطبق في الحاضنة 37 درجة مئوية واتركه لمدة 45 دقيقة. خلال هذا الوقت ، تأكد من عدم تعكير صفو الطبق. الآن ، سوف تلتزم مغذيات الطبق والخلايا الجذعية لن.
23. نقل الحل للخروج من صحن بيتري. والآن لدينا الحل الخلايا المسمى واحد من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.
24. ويمكن الآن أن تحسب الخلايا ، ويمكن إجراء اختبار أزرق التريبان عليها.
25. الخلايا جاهزة للتصوير!

OI هي تقنية تصوير جديدة نسبيا ، استنادا إلى الكشف عن مضان. OI حساسة مثل تقنيات التصوير قائف مشع مقرها ، ولكن لا يرتبط مع أي التعرض لأشعة. OI يوفر وسيلة فعالة لتعقب الخلايا غير جراحية ومتكررة ، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة الهجرة الخلية إلى موقع الهدف. أحد أوجه القصور الرئيسية لهذا الأسلوب هو اختراق محدود من الانسجة في الجسم الحي تحقيقات الفلورسنت. وهكذا ، فإن تراكم التتبع في الأنسجة العميقة ، أكثر من حوالي 50-10 سم من سطح الجلد ، قد لا يتم الكشف عن. وتقتصر التطبيقات السريرية الحالية إلى تقنيات مثل التصوير السطحي بالمنظار ، والقلب والأوعية الدموية للشبكية (Funovics وآخرون 2003) ولكن هذا المجال من البحث سوف تستمر في التوسع من خلال الاعتراف الإمكانيات الهائلة التي توفرها في تعقب الخلايا الحية.