Actina Co-sedimentazione di analisi, per l'Analisi del Binding Protein a F-Actina

1. Preparazione di actina

La fonte di actina utilizzati in questo test è stato piastrine umane non-muscolare (β-actina) ottenuto dal citoscheletro Inc. aliquote di Borsa di 10 sono tenute mg / ml nel congelatore -70 ° C. Per l'analisi, l'actina è diluito a 0,4 mg / ml in un tampone contenente 5 mM Tris pH 8, 0.2 mm CaCl _2, 0,2 mM ATP e 0,5 mM DTT, centrifugato a 20.000 g per 10 minuti a 4 ° C. Il surnatante, che è actina monomerica è pronto per essere polimerizzato. Polimerizzazione di actina è indotta con l'aggiunta 50 mM KCl, 1 mM ATP e 2 mM MgCl _2. La polimerizzazione avviene a temperatura ambiente per 1 ora.

2. La preparazione di proteine

In questo saggio, stiamo usando il C-terminale della Talin, che è stato purificato come GST-tag delle proteine. Le proteine ​​da utilizzare nel saggio è sottoposto ad una centrifugazione ad alta velocità di pre-clear di aggregati prima dell'incubazione con F-actina.
La proteina è filata a 100.000 g in un ultracentrifuga Beckman per 20 minuti a 22 º C.

3. Actina-proteina incubazione

La quantità di actina e proteine ​​in un test possono variare. In questo esempio stiamo usando actina in eccesso. Normalmente, un rapporto molare è calcolato, ad es. uno rapporto 4:1 molare di actina alle proteine.

Nel saggio successivo, il volume finale di reazione è di 150 microlitri. Il buffer in cui vengono incubate le proteine ​​e F-actina dipenderà la proteina da testare e le condizioni richieste. In questo esempio, utilizziamo un tampone contenente 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl ₂ e ₂ mM MgCl _2. La proteina e F-actina sono incubati in tampone per 1 ora a temperatura ambiente.

4. Sedimentazione di F-actina

Dopo l'incubazione, i campioni sono filata a 100.000 g a 22 ° C. Usiamo un ultracentrifuga Beckman nel video. Il rotore viene accuratamente rimossa in modo da non disturbare il pellet.

5. Analisi di proteine ​​co-sedimentazione con F-actina

I surnatanti sono accuratamente rimosse pipettando in una provetta Eppendorf e 5 X Laemmli SDS-PAGE tampone campione viene aggiunto. Un volume adeguato di 1 X Laemmli SDS-PAGE tampone campione viene aggiunto al pellet rimanenti, pipettati su e giù, e trasferiti a nuovi tubi eppendorf. Le quantità relative di proteine ​​nel pellet e surnatanti vengono analizzati in seguito alla loro separazione mediante SDS-PAGE e colorazione Coomassie blu del gel o Western blotting.

Al fine di determinare la specificità di interazione con la proteina actina, l'actina concentrazione-dipendente co-sedimentazioni possono essere eseguite. Per questo tipo di esperimento, un importo fisso della proteina e una serie di quantità crescenti di actina sono incubati, e l'analisi è eseguita come sopra descritto.

Actina co-sedimentazione è un semplice test in vitro per analizzare le proteine ​​specfic vincolante a F-actina. In questo video, si dimostra un esempio di come un semplice co-actina sedimentazione può essere effettuata. Mostriamo come preparare F-actina, preparare la proteina da testare e la procedura di actina co-sedimentazione. Un certo numero di punti dovrebbero essere considerati durante lo svolgimento actina co-sedimentazione saggi. Per esempio, i componenti del buffer per l'incubazione può variare a seconda della proteina da testare e pH, temperatura e concentrazione salina può influenzare il legame di F-actina. Abbiamo dimostrato un legame semplice a F-actina, tuttavia questo tipo di analisi può essere elaborata e utilizzata per determinare la specificità di legame di un dominio di proteine ​​o di proteine ​​a F-actina.