Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

1. Beredning av aktin

Källan till aktin som används i denna analys var icke-muskel humana trombocyter (β-aktin) som erhållits från cytoskelettet Inc. Stock alikvoter vid 10 mg / ml förvaras i -70 º C frys. För analysen är aktin utspädd till 0,4 mg / ml i en buffert innehållande 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl _2, 0,2 mM ATP och 0,5 mM DTT, centrifugeras vid 20 tusen g under 10 minuter vid 4 ° C. Supernatanten, som är monomera aktin är redo att polymeriserat. Actin polymerisation induceras genom tillsats 50 mM KCl, 1 mm ATP och 2 mm MgCl _2. Den polymerisation sker vid rumstemperatur under 1 timme.

2. Beredning av protein

I denna analys använder vi C-ändstationen av Talin, som har renats i en GST-märkta proteinet. Det protein som ska användas i analysen utsätts för en snabb centrifugering att i förväg klara av aggregat före inkubering med F-aktin.
Proteinet är spunnet på 100 tusen g på en Beckman ultracentrifugen i 20 minuter vid 22 º C.

3. Aktin-protein Inkubering

Mängden aktin och protein i en analys kommer att variera. I detta exempel använder vi aktin i överskott. Normalt är en molförhållandet beräknas, t ex. en 4:01 molförhållandet mellan aktin till protein.

I den följande analysen är den sista reaktionen volym 150 l. Den buffert som protein och F-aktin inkuberas beror på proteinet som ska testas och på de villkor som krävs. I detta exempel använder vi en buffert som innehåller 10 mM Tris pH 7,0, 1 mm ATP, 0,2 mM DTT, 1 mm EGTA, 0,1 mM CaCl ₂ och 2 mm MgCl _2. Det protein och F-aktin inkuberas i bufferten i 1 timme i rumstemperatur.

4. Sedimentation av F-aktin

Efter inkubation är de proverna centrifugeras vid 100 tusen g vid 22 º C. Vi använder en Beckman ultracentrifugen i videon. Rotorn är försiktigt bort för att inte störa pellets.

5. Analys av protein tillsammans sedimentering med F-aktin

Den supernatanterna avlägsnas omsorgsfullt genom att pipettera till ett Eppendorf-rör och 5 x Laemmli SDS-PAGE prov buffert tillsätts. En lämplig volym av 1 X Laemmli SDS-PAGE prov buffert läggs till pellets kvar, pipetteras upp och ner, och överföras till nya Eppendorf-rör. Den relativa mängden protein i pellets och supernatanterna analyseras efter deras separation av SDS-PAGE och Coomassie Blå färgning av gel eller Western blotting.

För att bestämma specificiteten av protein interaktion med aktin, aktin koncentrationsberoende samarbete sediment kan utföras. För denna typ av experiment, ett fast belopp av det protein och en serie av ökande mängder aktin inkuberas och analys görs enligt ovan.

Aktin samarbete sedimentering är ett enkelt in vitro-analys för att analysera specfic proteiner binder till F-aktin. I denna video visar vi ett exempel på hur en enkel aktin samarbete sedimentering kan ske. Vi visar hur man förbereder F-aktin, förbereda det protein som ska testas och det förfarande av aktin co-sedimentering. Ett antal punkter bör beaktas vid utförandet av aktin samarbete sedimentering analyser. Till exempel kan bufferten komponenter för odling varierar beroende på det protein som ska testas och pH, ​​temperatur och salthalt kan påverka bindningen till F-aktin. Vi har visat en enkel bindning till F-aktin, men denna typ av analys kan tas fram på och används för att fastställa bindande specificiteten hos ett protein eller protein domän till F-aktin.