Co-actine sédimentation Assay; pour l'analyse des Binding Protein à F-actine

1. Préparation de l'actine

La source de l'actine utilisé dans cet essai était non-musculaires plaquettes humaines (β-actine) obtenu à partir de aliquotes Cytosquelette Stock Inc à 10 mg / ml sont conservés dans le congélateur -70 ° C. Pour le dosage, l'actine est dilué à 0,4 mg / ml dans un tampon contenant 5 mM de Tris pH 8, 0,2 _mM de CaCl2, 0,2 mM d'ATP et 0,5 mM de DTT, centrifugé à 20000 g pendant 10 min à 4 º C. Le surnageant, qui est l'actine monomérique est prêt à être polymérisée. Polymérisation de l'actine est induite par le KCl 50 mM outre, ATP 1 mM et 2 _mM de MgCl2. La polymérisation se produit à température ambiante pendant 1 heure.

2. Préparation de protéines

Dans ce test, nous utilisons le C-terminale de Talin, qui a été purifié comme une protéine GST-étiquetés. La protéine à être utilisé dans le dosage est soumis à une centrifugation à grande vitesse à pré-clair de granulats avant l'incubation avec la F-actine.
La protéine est filée à 100 000 g dans une ultracentrifugeuse Beekman pendant 20 minutes à 22 º C.

3. Actine-protéines d'incubation

Le montant de l'actine et de protéines dans un test varie. Dans cet exemple nous utilisons l'actine en excès. Normalement, un rapport molaire est calculé, par exemple. un rapport de 4:1 molaire de l'actine à la protéine.

Dans le test suivant, le volume final de réaction est de 150 pi. La mémoire tampon dans laquelle la protéine et la F-actine sont incubés dépendra de la protéine à tester et sur les conditions requises. Dans cet exemple, nous utilisons un tampon contenant 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM de DTT, 1 mM EGTA, 0,1 _mM de CaCl2 et MgCl2 ₂ mM. La protéine et la F-actine sont incubés dans le tampon pendant 1 heure à température ambiante.

4. La sédimentation de F-actine

Après l'incubation, les échantillons sont centrifugés à 100 000 g à 22 º C. Nous utilisons une ultracentrifugeuse Beckman dans la vidéo. Le rotor est soigneusement enlevé afin de ne pas déranger les boulettes.

5. L'analyse des protéines co-sédimentation avec F-actine

Les surnageants sont soigneusement éliminé par pipettage dans un tube Eppendorf et 5 X tampon Laemmli SDS-PAGE de l'échantillon est ajouté. Un volume approprié de tampon Laemmli 1 X échantillon SDS-PAGE est ajouté aux pastilles restantes, pipette de haut en bas, et transférés à de nouveaux tubes Eppendorf. Les quantités relatives de protéines dans les pastilles et les surnageants sont analysés suivant leur séparation par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie du gel ou Western Blot.

Afin de déterminer la spécificité de l'interaction des protéines avec l'actine, l'actine dépendante de la concentration de co-sédimentations peut être effectuée. Pour ce genre d'expérience, d'un montant fixe de la protéine et une série de quantités croissantes de l'actine sont incubés, et l'analyse est effectuée comme décrit ci-dessus.

L'actine co-sédimentation est un simple test in vitro pour analyser les protéines se liant à specfic F-actine. Dans cette vidéo, nous démontrons un exemple de comment une simple co-actine de sédimentation peut être effectuée. Nous montrons comment préparer la F-actine, préparer la protéine à tester et à la procédure de l'actine de co-sédimentation. Un certain nombre de points doivent être considérés lors de la réalisation d'actine co-sédimentation des dosages. Par exemple, les composants du tampon pour l'incubation peut varier en fonction de la protéine à tester et le pH, la température et la concentration en sel peut affecter la liaison à la F-actine. Nous avons démontré une liaison simple à la F-actine, toutefois ce type de dosage peuvent être élaborés et utilisés pour déterminer la spécificité de liaison d'un domaine protéine ou protéine à F-actine.