The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
School of Engineering, University of California Merced - UC Merced
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 107.22.25.119, User IP: 107.22.25.119, User IP Hex: 1796610423
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Chen, C., Pegan, J., Luna, J., Xia, B., McCloskey, K., Chin, W., et al. Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (13), e692, doi:10.3791/692 (2008).
גופים Embryoid (EB) הם אגרגטים של תאים עובריים. הדרך הנפוצה ביותר ליצירת אגרגטים אלה היא השיטה ירידה תלוי, גישה מייגע של pipetting מספר שרירותי של תאים לתוך צלחות היטב. אינטראקציות בין בתאי גזע בכפייה בסמיכות זה לזה מקדמת את הדור של EBS. בגלל התקשורת בכל בארות יש להחליף באופן ידני כל יום, גישה זו היא אינטנסיבית באופן ידני.
יתר על כן, בגלל פרמטרים סביבתיים כולל תאים תאים, תא מסיסים אינטראקציות גורם, pH, זמינות החמצן יכול להיות פונקציות של גודל EB, אוכלוסיות תאים המתקבל טיפות תלוי המסורתי יכול להשתנות באופן דרמטי, גם כאשר בתרבית בתנאים זהים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי אכן מספר ראשוני של התאים המרכיבים את המצרף יכולה להיות השפעה משמעותית על התמיינות בתאי גזע. פיתחנו שיטה תרבות פשוטה, מהירה, וניתן להרחבה לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid. לבסוף, תאים אלה נגישים בקלות לניתוח ניסויים נוספים. שיטה זו ניתנת לכל מעבדה ואינה דורשת ציוד ייעודי. אנו להדגים שיטה זו על ידי יצירת גופים embryoid באמצעות תא אדום ניאון העכבר קו (129S6B6-F1).
1. ביצוע טיפולית נידחת עובש
2. ביצוע PDMS microwells
3. תאים של השמנה microwells
4. תא הדגירה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
פיתחנו שיטה תרבות פשוטה, מהירה, וניתן להרחבה לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated (יצוק מ-טיפולית Dinks) ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid. לבסוף, תאים אלה נגישים בקלות לניתוח ניסויים נוספים. שיטה זו ניתנת לכל מעבדה ואינה דורשת ציוד ייעודי כי אנחנו לייתר את הצורך photolithography. אנחנו יכולים לשנות את הגודל של microwells וכן ריכוז של תאים / בארות כדי לשנות את המספר והגודל של הגופים embryoid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
ברצוננו להודות על התמיכה CIRM של עבודה זו. קו התא נתרם בנדיבות בבית החולים הר סיני, טורונטו, אונטריו מד"ר Andras נאגי.
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A | |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 | |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS | Reagent | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| BMP-4 | Reagent | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 | |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 | |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 | |
| D-mercapt–thanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon International | ESG1106 | |
| Printer | Tool | Hewlett-Packard | Laser Jet 2420d | |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 | |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol):(for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml2mM L-glutamine: .5ml; 1mlNEAA : .5ml; 1mlLIF: 100ul; 200ulBMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ulDiluted BME: 50ul; 100ul(Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | ||||
1. Keller, G.M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol ,7,862-869 (1995).
2. Doetschman, T.C., Eistetter, H.,Katz, M., Schmidt, W., & Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology 87 27-45 (1985).
3. Park, J. , Cho, C. H. , Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A.W., & Yarmush, M.L., Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation, Lab Chip, 2007, 7, 8,1018-1028 (2007).
4. Koike, M. Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104(4):294-9 (2007).
5. Hwang, N.S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells Advanced Drug Delivery Reviews 60 (2),199-214 (2008).
6..Adelman, C.A, Chattopadhyay, S. , and Bieker J.J, The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media, Development 129, 539-549 (2002)
7. Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri O.V, Sills E.S. , and Palermo, G.D, Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model, J Transl Med. 4: 20 ( 2006).
What a useful video! Thank you very much for innovating this method and for making it so user-friendly for others in the scientific community.
Best,
Kriti Sharma
Duke University Dep't of Biology, Durham, NC
1
ReplyPosted by: KritiMay 1, 2008, 1:25 PM