The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
School of Engineering, University of California Merced - UC Merced
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 107.22.156.205, User IP: 107.22.156.205, User IP Hex: 1796644045
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Chen, C., Pegan, J., Luna, J., Xia, B., McCloskey, K., Chin, W., et al. Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (13), e692, doi:10.3791/692 (2008).
Embriyoid organları (EB), embriyonik kök hücrelerin agrega. Bu agrega oluşturarak en yaygın yolu, asılı damla yöntemi, kuyucuğu keyfi bir hücre sayısı pipetleme zahmetli bir yaklaşım. Birbirlerine yakın zorla kök hücreleri arasındaki etkileşimler EBS üretimi teşvik etmektedir. Kuyuların her medya her gün el değiştirebileceği sahip olduğundan, bu yaklaşımın elle yoğundur.
Ayrıca, aynı koşullar altında kültüre, hücre-hücre, hücre eriyen faktör etkileşimleri, pH ve oksijen kullanılabilirliği de dahil olmak üzere çevresel parametrelerin EB boyutu fonksiyonlar olabilir, çünkü, geleneksel asılı damla elde edilen hücre popülasyonlarının bile dramatik olarak değişebilir. Son çalışmalar gerçekten ilk sayıda toplu oluşturan hücrelerin kök hücre farklılaşması üzerinde önemli etkilere sahip olduğunu göstermiştir. Biz microfabricated kuyu içine hücrelerin önceden tanımlı numaralar yüklemek ve embriyoid vücut gelişimi için onları korumak için, basit, hızlı ve ölçeklenebilir bir kültür yöntemi geliştirdik. Son olarak, bu hücreler daha fazla analiz ve deney için kolayca ulaşılabilir. Bu yöntem, herhangi bir laboratuvar için uygun ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Biz kırmızı floresan fare hücre hattı (129S6B6 F1) kullanarak embriyoid organları oluşturarak bu yöntemi göstermektedir.
1. Shrinky-Dink Kalıp
2. PDMS mikro oyukların yapma
3. Mikro oyukların içinde Yakalama hücreleri
4. Hücre inkübasyon
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Biz microfabricated kuyuları (Shrinky-Dinks kalıplı), hücrelerin önceden tanımlı numaralar yüklemek ve embriyoid vücut gelişimi için onları korumak için, basit, hızlı ve ölçeklenebilir bir kültür yöntemi geliştirdik. Son olarak, bu hücreler daha fazla analiz ve deney için kolayca ulaşılabilir. Bu yöntem, herhangi bir laboratuvar için uygun ve fotolitografi için gerek bırakmayacak, çünkü hiçbir özel ekipman gerektirir. Biz embriyoid organlarının sayısını ve boyutunu değiştirmek için mikro oyukların boyutu yanı sıra hücre / kuyu konsantrasyon değişebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
CIRM Biz bu işi destek için teşekkür etmek istiyorum. Hücre hattı cömertçe, Toronto Mount Sinai Hastanesi Dr. Andras Nagy bağışlanmıştır.
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A | |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 | |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS | Reagent | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| BMP-4 | Reagent | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 | |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 | |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 | |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon International | ESG1106 | |
| Printer | Tool | Hewlett-Packard | Laser Jet 2420d | |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 | |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol):(for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml2mM L-glutamine: .5ml; 1mlNEAA : .5ml; 1mlLIF: 100ul; 200ulBMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ulDiluted BME: 50ul; 100ul(Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | ||||
1. Keller, G.M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol ,7,862-869 (1995).
2. Doetschman, T.C., Eistetter, H.,Katz, M., Schmidt, W., & Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology 87 27-45 (1985).
3. Park, J. , Cho, C. H. , Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A.W., & Yarmush, M.L., Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation, Lab Chip, 2007, 7, 8,1018-1028 (2007).
4. Koike, M. Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104(4):294-9 (2007).
5. Hwang, N.S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells Advanced Drug Delivery Reviews 60 (2),199-214 (2008).
6..Adelman, C.A, Chattopadhyay, S. , and Bieker J.J, The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media, Development 129, 539-549 (2002)
7. Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri O.V, Sills E.S. , and Palermo, G.D, Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model, J Transl Med. 4: 20 ( 2006).
What a useful video! Thank you very much for innovating this method and for making it so user-friendly for others in the scientific community.
Best,
Kriti Sharma
Duke University Dep't of Biology, Durham, NC
1
ReplyPosted by: KritiMay 1, 2008, 1:25 PM