Shrinky-Dink Hängande Drops: Ett enkelt sätt att bilda och kultur Embryoid organ

1. Göra Shrinky-Dink Mold

1. Skriv det önskade mönstret på shrinky-Dink ark med hjälp av en bra definition skrivare.
2. Grädda shrinky-Dink ark i 163 ° C i ca 10 minuter, eller tills helt krympt och har fått en regelbunden form.
3. Efter shrinky-Dink mögel har svalnat, tills dränka den i en isopropanol bad hela ytan är knappt täckt.
4. Försiktigt, spraya lite aceton över formen och skaka behållaren några gånger. Lägg till fler isopropanol att tvätta bort aceton överskott och upprepa detta steg några gånger tills shrinky-mögel ser ren.
5. Sänk mögel i destillerat vatten i 10 minuter för att tvätta bort eventuell kvarvarande organiskt lösningsmedel.
6. Air Clean shrinky-mögel. Re-värma den i cirka 5 minuter vid 163 ° C. Detta kommer kompakta bläck och avdunsta resterande lösningsmedel.

2. Göra PDMS mikrobrunnar

1. Förbered en 10:01 PDMS / härdare blandning, och skaka kraftigt i några minuter.
2. Placera shrinky-Dink mögel i en liten petriskål. Häll PDMS blandningen tills den når ca 1 / 2 cm över formens yta.
3. Placera skålen under vakuum klocka att eliminera alla bubblor från PDMS blandning.
4. Placera skålen i ugnen vid 70 ° C, över natten.
5. Klipp av fasta PDMS från mögel och binda det till en glasskiva bara genom att utöva påtryckningar.
6. Kasta first brunn-chip, eftersom det har bläck rester incrusted mellan PDMS.
7. Upprepa denna procedur för att producera ett andra chip som är bläck-fri och har en mer definierad form.
8. Rengör brunn-chip med 70% etanol-lösning. Placera den i UV-ljuskällan i 10 minuter för att sterilisera den.

3. Svällning celler i mikrobrunnar

1. Räkna celler och späda ut dem i kultur media till önskad koncentration (beroende på hur många inledande celler i brunnar du vill). Till exempel, för att få cirka 10-15 celler per brunn (genomsnitt = 11, SD = 5,4, lastning sats = 93%) använde vi en koncentration av 8 × 10 ⁴ celler / ml. För en koncentration av 17 × 10 ⁴ celler / ml, skulle vi kunna få ett tillförlitligt mellan 25 och 35 celler per brunn (genomsnitt = 27,17857 SD = 7,7, lastning sats = 100%).
2. Placera försiktigt mikrobrunn chip i ett 50 ml centrifugrör innehållande en stelnad PDMS bas.
3. Tillsätt ca 2JDP ml av cellen lösningen.
4. Centrifugera i 5 minuter vid 760 rpm och 4 ° C.
5. Pipettera upp överflödig lösning och noggrant tvätta brunn med PBS 1X-lösning.
6. Placera brunn i en liten Petry maträtt, var försiktig när du tar chippet ur centrifugrör.
7. Tvätta cell överskott med 1 X PBS lösning.
8. Placera brunn chip i ett inverterat mikroskop för att kontrollera planerade antalet celler per brunn.
9. Inkubera brunn som innehåller celler under standardförhållanden.
   
   

4. Cell inkubation

1. Följ normala EB-protokollet i labbet.
2. Ändra mediet sakta från sidan av kammaren, undvika att störa cellen i brunn.

Vi har utvecklat en enkel, snabb och skalbar kultur metoden att läsa fördefinierade antalet celler i mikrofabricerade brunnar (gjutna från Shrinky-Dinks) och underhålla dem för embryoid kropp utveckling. Slutligen, dessa celler är lätt tillgängliga för vidare analys och experiment. Denna metod är mottaglig för någon labb och kräver ingen särskild utrustning för att vi undanröja behovet av fotolitografi. Vi kan variera storleken på mikrobrunnarna samt koncentrationen av celler / brunnar för att ändra antalet och storleken på embryoid organ.