The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
Departments of Radiology and Medicine (Cardiology), Stanford University School of Medicine
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 54.234.126.92, User IP: 54.234.126.92, User IP Hex: 921337436
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (14), e740, doi:10.3791/740 (2008).
وزاد اكتشاف الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) بشكل كبير من الأدوات المتاحة لعلماء الطب المهتمين في مجال الطب التجديدي. ومع ذلك ، الحقن المباشر للhESCs ، وخلايا متباينة من hESCs ، في الكائنات الحية وقد تم حتى الآن يعوقها موت الخلايا كبيرة ، وتشكيل مسخي ، ورفض استضافة المناعي. فهم في السلوك hESC المجراة بعد زرع يتطلب تقنيات التصوير الرواية لرصد توطين hESC طوليا ، والانتشار ، وقدرتها على البقاء. وقد أعطى المحققين التصوير الجزيئي وسيلة عالية الإنتاجية ، وغير مكلفة ، وحساسة لتعقب انتشار الخلايا في الجسم الحي خلال الأيام والأسابيع وحتى أشهر. وقد زاد هذا التقدم بشكل كبير في فهم حركية المكانية والزمانية لمن engraftment hESC ، والانتشار ، وتشكيل مسخي ، في الموضوعات الحية.
وثمة تقدم كبير في مجال التصوير الجزيئي على تمديد موسع فحوصات الجينات مراسل من البيولوجيا الجزيئية والخلوية في التصوير منصات متعددة في الجسم الحي الطريقة. هذه الجينات المراسل ، تحت سيطرة المروجين وهندستها القدرة على أن الاستفادة من آلية الخلية المضيفة ليالي النسخي ، يتم إدخالها في الخلايا باستخدام مجموعة متنوعة من أساليب ناقلات وغير الموجه. مرة واحدة في الخلية ، ويمكن جينات كتب مراسل constitutively إما أو فقط تحت ظروف محددة أو البيولوجية الخلوية ، اعتمادا على نوع من المروج المستخدمة. ثم يتم الكشف عن النسخ والترجمة من الجينات إلى بروتينات مراسل النشطة بيولوجيا مع الأجهزة وحساسة موسع (مثل كاميرات CCD) باستخدام إشارة المولدة للتحقيقات مثل مد luciferin.
لتجنب الحاجة للضوء مثير لتعقب الخلايا الجذعية في الجسم الحي كما هو مطلوب من أجل التصوير مضان ، تلألؤ بيولوجي نظم التصوير الصحفي الجين تتطلب تحقيقا خارجيا فقط تدار للحث على انبعاث الضوء. يراعة luciferase ، المستمدة من البرالس Photinus يراعة ، وهو الانزيم الذي يقوم بترميز يحفز D - luciferin إلى oxyluciferin ، المستقلب نشطة ضوئيا. ويمكن عندئذ أن تراقب النشاط البصري مع كاميرا CCD الخارجية. transduced ستابلي الخلايا التي تحمل الحمض النووي داخل مراسل بناء على الكروموسومات سيمر مراسل بناء الحمض النووي للخلايا ابنته ، والسماح لرصد الطولي للبقاء والانتشار hESC في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، لأنه مطلوب للتعبير مراسل الجين المنتج لتوليد الإشارات ، وقابلة للحياة الوالد وابنته الوحيدة الخلايا إنشاء إشارة تلألؤ بيولوجي ؛ الخلايا أفكارك أو ميتا لن.
في هذا الفيديو ، سيتم وصف المواد والأساليب المحددة اللازمة لتعقب وقف تكاثر الخلايا وتكوين مسخي مع التصوير تلألؤ بيولوجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
بالمقارنة مع وسائل أخرى مثل PET والتصوير بالرنين المغناطيسي ، وتلألؤ بيولوجي القرار المكاني المحدود وخفض اختراق الأنسجة نتيجة لضعف الطاقة نسبيا من الفوتونات (2-3 فولت) لهذه الأسباب أنها حتى الآن لم يتم تطبيق في الحيوانات الكبيرة. ومع ذلك ، تلألؤ بيولوجي لديها ميزة كونها منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية ، وغير الغازية ، مما يجعل من المرغوب فيه جدا عن الخلايا الجذعية في الجسم الحي في تتبع الحيوانات الصغيرة. ويمكن استخدام الجينات المراسل غير تلألؤ بيولوجي مثل يبني PET ومضان بالتزامن مع luciferase لخلق انصهار مراسل الجينات التي تتألف من مختلف المجالات التي تحتوي على جينات مراسل الفردية. على سبيل المثال ، مجموعتنا يستخدم الانصهار تتضمن بناء fluc ، موحودي بروتين فلوري الأحمر (mrfp) ، وفيروس الهربس البسيط اقتطاع ثيميدين كيناز (TTK ، وهو الجين مراسل PET) لتتبع طريقة متعددة من الخلايا الجذعية في سلوك الحيوانات الصغيرة. مع مرور الوقت ، قد الجينات مراسل ستابلي متكاملة تخضع لإسكات الجينات الصبغية من الأجهزة المحلية. يرتبط ارتباطا وثيقا الحساسية المورثة مراسل لإسكات الجينات لاختيار القيادة المروج تعبيرها. على سبيل المثال ، أسكت المروج المضخم للخلايا (pCMV) في hESCs. وكان مختبر نجاحنا جيدة مع المروج اليوبيكويتين - C الإنسان (العانة) إلى محرك تعبير عن الانصهار مزدوجة في بناء العديد من خطوط الخلايا hESC ، ولقد لاحظت فقدان الحد الأدنى من إشارة مرور الوقت.
في الختام ، وقبل hESC المستمدة من تجديد الخلايا تصبح ذات الصلة سريريا ، لا بد من التغلب على عقبات عدة البيولوجية الأساسية -- وهما أو موت الخلية المبرمج بعد زرع الخلايا المتمايزة ، وتشكيل خلايا غير متمايزة من مسخي ، والرفض المناعي عن طريق الكائن المضيف. هذه وغيرها من التحديات التي تسلط الضوء على الحاجة لengraftment hESC التتبع ، والبقاء والانتشار داخل الكائن المتلقي. وقد مكن تطوير تقنيات التصوير الجزيئي مثل يراعة مراسل الجين luciferase وكاميرات فائقة الحساسية CCD غير الغازية ، وتقييم المتكررة من موقع الخلية ، والهجرة ، والانتشار ، والتمايز في الجسم الحي. ومثل هذه التقنيات تساعد الترجمة دفع البيولوجيا hESC من المعمل نحو التطبيقات السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
بفضل تيم دويل ، دكتوراه ، ومركز ستانفورد للتصوير في الجسم الحي للحصول على المساعدة مع التصوير تلألؤ بيولوجي. أيضا بفضل هوانغ نغان ، دكتوراه لتقاسم تقنية الخلايا الجذعية لها على المشاركة في الحقن بمحلول المصفوفة. أخيرا ، بفضل ستيف فيلت ، دكتوراه للحصول على مساعدة رعاية الحيوانات البيطرية.
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Hyclone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | Stem Cell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth International, Inc | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | Techno Plastic Products | 92006 |
1. Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells 23, 772-780 (2005).
2. Laflamme, M.A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology 25, 1015-1024 (2007).
3. Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture condition. Int J Dev Biol 51, 371-378 (2007).
4. Schulz, T.C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci 4, 27 (2003).
5. Jiang, J., et al. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells 17, 17 (2007).
6. Swijnenburg, R.J., van der Bogt, K.E.A., Sheikh, A.Y., Cao, F. & Wu, J.C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology 18, 38-45 (2007).
7. Herschman, H.R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science 302, 605-608 (2003).
8. Lippincott-Schwartz, J. & Patterson, G.H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science 300, 87-91 (2003).
9. Contag, P.R., Olomu, I.N., Stevenson, D.K. & Contag, C.H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine 4, 245-247 (1998).
10. Bhaumik, S. & Gambhir, S.S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 377-382 (2002).
11. Tisi, L.C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta 457, 115-123 (2002).
12. Ray, P., Tsien, R. & Gambhir, S.S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res 67, 3085-3093 (2007).
13. Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation 113, 1005-1014 (2006).
14. Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells 9, 107-117 (2007).
15. Ray, P., De, A., Min, J.J., Tsien, R.Y. & Gambhir, S.S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res 64, 1323-1330 (2004).
16. Wu, J.C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics 6, 6234-6249 (2006).
17. Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol 11, 514-518 (2001).
18. Mohr, J.C., de Pablo, J.J. & Palecek, S.P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog 22, 825-834 (2006).
19. Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev 14, 378-383 (2005).
20. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells 22, 531-543 (2004).
21. Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R.G. & Thomson, J.A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells 21, 111-117 (2003).
22. Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L. & Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy 10, 1109-1120 (2004).
23. Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells 26, 119-126 (2008).
24. Liew, C.-G., Draper, J.S., Walsh, J., Moore, H. & Andrews, P.W. Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell
