In vitro e in vivo de imágenes de bioluminiscencia gen reportero de células estaminales embrionarias humanas

1. Construcción de doble reportero Gene fusión
   1. Con el fin de realizar imágenes de bioluminiscencia de células madre embrionarias humanas, primero tiene que obtener las células que expresan establemente un gen reportero de la luciferasa como luciferasa de luciérnaga impulsado por un promotor constitutivo como ubiquitina o EF1A.
   2. El objetivo de este protocolo es el gen reportero de aplicaciones, por lo que los procedimientos detallados que no se proporcionan aquí. Sin embargo, la estrategia general de nuestro laboratorio es el uso de un vector de construcción de fusión doble que contiene luciferasa de luciérnaga (fluctuaciones) y aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) separadas por un espaciador en pCDNA 3.1 +.
   3. En pocas palabras, nuestro gen de fusión doble se encontraba originalmente aguas abajo del promotor de citomegalovirus en pcDNA 3.1 (+), por lo que el fragmento de 3,3 kpb fue eliminado mediante la digestión NdeI y NotI y contundente final ligó en el sitio de clonación múltiple de una auto-inactivar (SIN ) vector lentiviral, bajo control de un promotor de la ubiquitina.
      
      
2. Transducción lentiviral
   1. hESCs pueden ser transducidas 3-5 días después de la aprobación a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 (título viral de aproximadamente 107 células se incubaron con 106).
   2. La acción viral descongelado se puede agregar directamente a los medios de células madre nuevas.
   3. Actualizar los medios de comunicación 12 y 24 horas más tarde.
   4. Después de 48 h, la eficiencia de transducción puede por evaluadas cualitativamente mediante microscopía de fluorescencia. Posteriormente, FACS se puede utilizar para aislar las células infectadas.
      
      
3. HESCs cultivo y la introducción de imágenes de Set-up
   1. La cultura de su hESCs positivo luciferasa en el alimentador sin condiciones. Por lo general siguen el estándar de protocolo de WiCell y el uso de placas de 6 pocillos recubiertas de factor de crecimiento reducido Matrigel, utilizando los medios de comunicación acondicionado o comercial, libre de enlace de los medios de comunicación.
   2. Para detectar las células positivas luciferasa, usted tendrá que tener la sonda reportero D-luciferina ya preparados. Para ello luciferina alícuota, en los preparativos 1-1.5 mL a una concentración final de 45 mg / ml. Mantener las alícuotas a -20 ° C cuando no estén en uso y evitar la exposición a la luz cubriendo con una toalla de papel, cuando no en el almacenamiento.
   3. Con el fin de visualizar las células positivas luciferasa, usamos IVIS 50 y 200 sistemas de imágenes IVIS (Xenogen Corporation, Alameda, CA). Este último sistema incluye un aparato integrado isoflourane y cámara de inducción de la anestesia temporal de animales pequeños.
      
      
4. En las imágenes de bioluminiscencia in vitro de hESCs
   1. En imágenes de bioluminiscencia in vitro, es importante mantener condiciones de esterilización. Por lo tanto, el sistema de imágenes deben ser estériles, de preferencia en una sala de cultivo celular.
   2. Antes de imágenes, eliminar los medios de comunicación celular y añadir lo suficiente para cubrir PBS las células. Por ejemplo, añada 1 ml de PBS en cada pocillo de una placa de 6 pocillos que contienen células madre de sus culturas.
   3. La proporción de D-luciferina de PBS debe ser 1:100, por lo que añadir 10 l de D-luciferina descongelado a cada pocillo de la placa de 6 pocillos.
   4. Espere un minuto, luego tomar una imagen con un tiempo de exposición de 1 segundo. Si la señal es débil, aumentar el intervalo entre la exposición y vuelva a intentarlo.
   5. La señal bioluminiscente refleja el número de células, por lo que los ensayos de cuantificación se puede realizar la señal que se correlacionan con el número de células diferentes.
      
      
5. Preparación de células de ratón y la inyección de imágenes in vivo
   1. Gen reportero de imagen proporciona un método de alto rendimiento, bajo costo y sensible para el seguimiento de las células después del trasplante durante días, semanas e incluso meses. Esto es especialmente importante, ya que las células madre trasplantadas a menudo forman teratomas, son rechazados por el sistema inmune del huésped, o simplemente morir.
   2. El método más simple para la formación de teratoma de imágenes in vivo, es la inyección hESCs que expresan el gen reportero de la luciferasa de luciérnaga en la espalda de ratones SCID y adquirir imágenes bioluminiscentes con el sistema de IVIS.
   3. Cuando esté listo para el trasplante de las células, el uso dispasa o colagenasa para aflojar las células, lavar varias veces, y suspender en una mezcla 1:1 del factor de crecimiento reducido matrigel y DMEM. Por lo general lo primero que mezclar las células con DMEM fría y luego añadir en el matrigel. Para cada sitio de la inyección subcutánea, se inyecta 200.000 células suspendidas en un volumen de 50 a 100 ul de la mezcla de matrigel / DMEM. El número de células se pueden ajustar en función de su aplicación. Recuerde que debe mantener todo en hielo antes de la inyección.
   4. Una vez que las células están listas, anestesiar el ratón, colocándolo en la caja de la inducción con isoflurano flujo de encendido. Después de 1-5 minutos, el ratón está dormido y se puede colocar en la mesa de operaciones continuas con isoflurano.
   5. Porque la piel natural de auto-fluorescencia y pueden oscurecer la imagen bioluminiscente, que tendrá que eliminar el vello de la cara posterior del ratón. La forma más sencilla de hacer esto es utilizar una máquina de afeitar eléctrica, pero también puede utilizar la depilación-geles. Limpie con alcohol para esterilizarla piel después
   6. A continuación, establecer la suspensión de su celda en una jeringa. 23 a 27 agujas de calibre mejor trabajo, ya que no va a tapar con las células. Si la aguja es demasiado grande (<calibre 23), el trayecto de la aguja puede dejar un gran agujero a través del cual las células pueden tener fugas de vuelta.
   7. Inyectar las células en la piel en la espalda del ratón. Porque la piel es muy floja, con el pulgar e índice para pellizcar y estirar la zona que desee inyectar. Se inyecta bajo la piel, teniendo cuidado de no perforar demasiado profundamente. Además, trate de mantener la aguja se deslice fuera del sitio de la inyección, mientras que el émbolo: esto evitará la creación de un agujero en la piel a través de la cual las células pueden tener fugas si se intenta inyectar de nuevo.
   8. Después que las células se inyectan, esperar unas horas para permitir que el ratón para despertar y empezar a correr antes de volver a anestesiar a imágenes de bioluminiscencia. Si lo hace, evita la toxicidad isoflurano.
      
      
6. En imágenes de bioluminiscencia in vivo de las células trasplantadas
   1. Para obtener imágenes de toda la bioluminiscencia animal, hacemos una inyección intraperitoneal de D-luciferina a 375 peso mg / kg. Pesar al animal para calcular la dosis antes de la inyección.
   2. Inyectar el D-luciferina en el peritoneo, justo al lado de la línea media. Tenga cuidado de no ir demasiado profundo o puede dañar los órganos internos. Si el ratón comienza a despertar, volver a meterla en la caja de octavos de final y esperar un minuto o dos. En los ratones, la bioluminiscencia máximo ocurre generalmente 15-40 minutos después de la inyección.
   3. Recuerde que debe colocar el papel negro mate en el cuadro de imagen para ayudar a absorber cualquier luz no emitida por el hESCs. Coloque el ratón (hasta parte trasera) en la cámara de imágenes con isoflurano, en la parte superior del papel negro. Comience con un tiempo de exposición de 10 segundos. Si la señal está saturada, pruebe a reducir el tiempo de exposición, si es demasiado débil, incremento de la exposición.
   4. Una vez que el tiempo de exposición de la señal ha sido optimizado para el ratón, comenzar a tomar imágenes cada minuto hasta que la señal llega a un máximo. Esto se logra mejor utilizando el software de imágenes para seleccionar "regiones de interés (ROI)", que cubren la zona de inyección. Por el control de la intensidad de la señal en cada retorno de la inversión puede determinar con facilidad cuando la señal empieza a disminuir, lo que indica que la intensidad de la señal ha alcanzado el máximo. La máxima de la señal debe ser utilizado como sus datos finales.
   5. Cuando estés satisfecho con tus imágenes, eliminar el ratón de isoflurano y deje que se despierta en su jaula. Por lo general, el ratón debe despertar dentro de 15 minutos.
   6. Reportero de la bioluminiscencia de imágenes de genes puede repetirse a diario, semanal y mensual durante el tiempo que el hESCs sobrevivir en el animal. Señal de un teratoma en desarrollo aumentará de forma exponencial con el tiempo, típicamente del orden de semanas, ya que el hESCs empiezan a proliferar.
   7. Después de la evolución en el tiempo deseado de imágenes de bioluminiscencia se adquiere, el animal puede ser sacrificado, y las secciones de tejido utilizado para el estudio histológico.

En comparación con otras modalidades como la PET y la RM, la bioluminiscencia tiene una resolución espacial limitada y penetración en los tejidos debido a la reducción de la energía relativamente débil de los fotones emitidos (2-3 eV), por estas razones que hasta ahora no ha sido aplicable en los animales grandes. Sin embargo, la bioluminiscencia tiene la ventaja de ser de bajo costo, alto rendimiento, y no invasiva, por lo que es muy conveniente que en las células madre in vivo de seguimiento en pequeños animales. Bioluminiscencia no los genes indicadores, tales como construcciones de PET y de fluorescencia se puede utilizar en conjunción con la luciferasa para crear un gen de fusión que se compone de diferentes dominios que contienen los genes reportero individual. Por ejemplo, nuestro grupo utiliza una construcción de fusión que contienen fluctuaciones, monomérico proteína fluorescente de color rojo (mRFP), y el virus del herpes simple truncado la timidina quinasa (TTK, un gen reportero PET) para el seguimiento de múltiples modalidades de comportamiento de las células madre en animales pequeños. Con el tiempo, integrado de forma estable genes reporteros pueden ser objeto de silenciamiento de genes por el mecanismo cromosómico endógeno. Susceptibilidad de un gen reportero de silenciamiento de los genes está estrechamente relacionado con la elección del promotor de la conducción de su expresión. Por ejemplo, el promotor de citomegalovirus (pCMV) es rápidamente silenciada en hESCs. Nuestro laboratorio ha tenido mucho éxito con los humanos ubiquitina-C promotor (púbico) para dirigir la expresión de una doble fusión en la construcción de varias líneas de células madre de células, y se ha observado mínima pérdida de señal en el tiempo.

En conclusión, antes de que células madre derivadas de la regeneración celular se vuelve clínicamente relevante, varios obstáculos biológicos básicos debe ser superada - a saber, la muerte celular o apoptosis tras el trasplante de células diferenciadas, la formación de teratoma de células indiferenciadas, y el rechazo inmune por parte del organismo huésped. Estos y otros retos destacan la necesidad de injerto células madre de seguimiento, la supervivencia y proliferación en el organismo receptor. El desarrollo de técnicas de imagen molecular, como el gen reportero de luciferasa de luciérnaga y ultra-sensibles cámaras CCD ha permitido no invasiva, la evaluación repetitiva de ubicación de la celda, la migración, proliferación y diferenciación in vivo. Tecnologías de este tipo ayudará a impulsar la traducción de la biología de células madre desde el laboratorio hacia aplicaciones clínicas.