In vitro och in vivo mareld Reporter Gene avbildning av mänskliga embryonala stamcellslinjer

1. Konstruktion av Double Fusion Reporter Gene
   1. För att kunna utföra mareld avbildning av mänskliga embryonala stamceller måste du först få celler som stabilt uttrycka en luciferas reporter gen som eldfluga luciferas drivs av en konstitutiv promotor som Ubiquitin eller EF1a.
   2. Fokus i detta protokoll är på tillämpningar reporter gen, så detaljerade förfaranden inte tillhandahålls här. Men vår labb övergripande strategi att använda en dubbel vektor fusion konstruktion som innehåller eldfluga luciferas (fluktuationer) och förbättrad grönt fluorescerande protein (EGFP) åtskilda av en spacer inom pCDNA 3,1 +.
   3. Kort sagt, var vår dubbla fusion gen ursprungligen belägen nedströms cytomegalovirus promotor i pCDNA 3,1 (+), så 3,3 KBP fragmentet var censurerade med NdeI och Noti matsmältningen och trubbig slut knyts ihop i flera kloning platsen för en själv inaktivera (SIN ) Lentiviral vektor, under kontroll av en Ubiquitin promotor.
      
      
2. Lentiviral Transduction
   1. hESCs kan transduced 3-5 dagar efter passagen på en mångfald av infektion (MOI) av 10 (virala titer på cirka 107 inkuberas med 106 celler).
   2. Den upptinade virus lager kan läggas direkt till frisk hESC medier.
   3. Uppdatera media 12 och 24 timmar senare.
   4. Efter 48 timmar kan transduktion effektiviteten genom kvalitativt utvärderas med hjälp av fluorescensmikroskopi. Därefter kan FACS användas för att isolera infekterade celler.
      
      
3. Odling hESCs och introduktion till bildbehandling Set-up
   1. Kultur din luciferas positiva hESCs i feeder-fria förhållanden. Vi följer vanligtvis standard WiCell-protokollet och använder 6-brunnars plattor överdragna med tillväxtfaktor minskad Matrigel, antingen betingad media eller kommersiella, feeder-fria medier.
   2. Att upptäcka luciferas positiva celler, måste du ha reporter sond D-luciferin redan förberett. För att göra detta, alikvot luciferin i 1-1,5 ml förberedelser på en slutlig koncentration på 45 mg / ml. Håll alikvoter vid -20 ° C när den inte används och undvika exponering för ljus genom att täcka med pappersduk när de inte i lager.
   3. För att visualisera luciferas positiva celler, använder vi IVIS 50 och IVIS 200 Imaging Systems (Xenogen Corporation, Alameda, Kalifornien). Det senare systemet omfattar en integrerad isoflourane apparater och induktionskammare för tillfällig bedövning av små djur.
      
      
4. In vitro bioluminescence avbildning av hESCs
   1. För in vitro-bioluminescens avbildning, är det viktigt att bibehålla sterila förhållanden. Därför bör Imaging System vara sterila, helst i en cellkultur rum.
   2. Innan avbildning, ta bort cellen media och lägga lagom PBS för att täcka cellerna. Till exempel Tillsätt 1 mL PBS i varje brunn på en 6-brunnar innehåller din hESC kulturer.
   3. Förhållandet mellan D-luciferin till PBS bör 1:100, så lägg till 10 mikroliter av den upptinade D-luciferin till varje brunn på 6-brunnar.
   4. Vänta en minut, sedan ta en bild med en exponeringstid på 1 sekund. Om signalen är svag, öka exponeringen intervall och försök igen.
   5. Den självlysande signalen speglar mobilnummer, så kvantifiering analyser kan utföras som korrelerar signalen med olika cell nummer.
      
      
5. Beredning av mus och injicera celler för in vivo imaging
   1. Reporter gen bildbehandling ger en hög genomströmning, billig och känslig metod för att spåra celler efter transplantation över dagar, veckor och även månader. Detta är särskilt viktigt eftersom transplanterade stamceller ofta utgör teratom, avslås av värdens immunsystem, eller helt enkelt dö.
   2. Den enklaste metoden för avbildning teratom bildas in vivo är att injicera hESCs som uttrycker den eldfluga luciferas reporter gen i ryggen på SCID möss och skaffa självlysande bilder med IVIS systemet.
   3. När du är redo att transplantera celler, använder dispase eller kollagenas att lossa cellerna, tvätta flera gånger, och avbryta dem i en 1:1 blandning av tillväxtfaktor reducerat matrigel och DMEM. Typiskt vi blandar först cellerna med kylda DMEM och sedan lägga i matrigel. För varje subkutan injektionsstället, injicera vi 200 tusen celler upphängd i ett 50-100 ul volym matrigel / DMEM blandning. Cellen Antalet kan justeras beroende på din ansökan. Kom ihåg att hålla allt på is före injektion.
   4. När cellerna är redo, söva musen genom att placera den i induktion låda med isofluran flöde påslagen. Efter 1-5 minuter är musen sover och kan placeras på operationsbordet med kontinuerlig isofluran.
   5. Eftersom päls naturligt automatisk fluorescerar och kan maskera det självlysande bilden, kommer vi att behöva ta bort hår från baksidan av musen. Det enklaste sättet att göra detta är att använda en elektrisk rakapparat, men du kan även använda hår-borttagning geler. Torka med alkohol för att steriliserahuden efteråt
   6. Nästa, dra upp din cellsuspension i en spruta. 23 till 27 gauge nålar fungerar bäst eftersom de inte kommer att täppa upp med celler. Om nålen är för stor (<23 gauge) nålen tarmkanalen kan lämna ett stort hål genom vilken cellerna kan läcka tillbaka ut.
   7. Injicera cellerna under huden i musen rygg. Eftersom huden är ganska lös, använd tummen och pekfingret för att nypa och sträcka ut det område du vill injicera. Injicera under huden, se till att inte punktera alltför djupt. Försök också att hålla nålen glider ut från injektionsstället och samtidigt trycka in kolven: Detta kommer att förhindra att skapa ett hål i huden genom vilken cellerna kan läcka om du försöker injicera igen.
   8. Efter att cellerna injiceras, vänta ett par timmar så att musen för att vakna upp och springa runt innan de anesthetizing för bioluminescens avbildning. Om du gör det undviker isofluran toxicitet.
      
      
6. In vivo bioluminescence avbildning av transplanterade cellerna
   1. För hela djuret mareld bildbehandling, gör vi en intraperitoneal injektion av D-luciferin på 375 mg / kg kroppsvikt. Väg djuret för att beräkna doseringen före injektion.
   2. Injicera D-luciferin i bukhinnan, strax utanför mittlinjen. Var noga med att inte gå för djupt eller du kan skada inre organ. Om musen börjar vakna upp, lägg tillbaka den i knockout boxen och vänta en minut eller två. För möss, uppstår den maximala mareld vanligen 15-40 minuter efter injektionen.
   3. Kom ihåg att placera matt svart papper i bildbehandling rutan för att hjälpa absorbera ljuset inte avges av hESCs. Placera musen (baksidan upp) i avbildning kammare med isofluran, på toppen av svart papper. Börja med en exponeringstid på 10 sekunder. Om signalen är mättad, försöka minska exponeringstiden, om för svag, öka exponeringen.
   4. När signalen exponeringstiden har optimerats för musen, börja ta bilder varje minut tills signalen når sitt maximum. Detta görs bäst genom att använda bildprogram att välja "områden av intresse (ROI)" som döljer dina injektionsställen. Genom att övervaka signalstyrkan på varje ROI kan du enkelt avgöra när signalen börjar minska, vilket visar att den maximala signalstyrkan har uppnåtts. Den maximala signalen bör användas som din slutliga data.
   5. När du är nöjd med dina bilder, ta bort musen från isofluran och låta den vakna upp i sin bur. Vanligtvis ska musen vaknar inom 15 minuter.
   6. Bioluminescence reporter gen avbildning kan upprepas dagligen, veckovis och månadsvis så länge de hESCs överleva i djuret. Signal från ett utvecklingsland teratoma kommer att öka exponentiellt med tiden, oftast i storleksordningen veckor, eftersom hESCs börjar föröka sig.
   7. Efter önskad tid under bioluminescens bilder förvärvas, kan djuret offras och vävnadssnitt används för histologi.

Jämfört med andra metoder såsom PET och MRI, har bioluminescens begränsad rumslig upplösning och minskat in i vävnaderna på grund av den relativt svaga energin som avges fotoner (2-3 eV), av dessa skäl har det hittills inte varit tillämplig i stora djur. Har dock bioluminescens fördelen att vara låg kostnad, hög genomströmning, och icke-invasiv, vilket gör det mycket önskvärt för in vivo stamceller spårning i små djur. Icke-bioluminescence reporter gener som PET och fluorescens konstruktioner kan användas tillsammans med luciferas för att skapa en gen fusion reporter som består av olika domäner som innehåller den enskilde reportern gener. Till exempel använder vår grupp en fusion konstruktion som innehåller fluktuationer, monomera rött fluorescerande protein (mrfp) och herpes simplex virus trunkerad tymidinkinas (TTK, en PET-reporter gen) för multimodalitet spårning av stamceller beteende hos små djur. Med tiden kan stabilt integrerad reporter generna vara föremål för utsläckning av geners uttryck med den endogena kromosomala maskiner. En reporter gen mottaglighet för geners uttryck hänger nära samman med valet av promotorn kör sitt uttryck. Till exempel är cytomegalovirus promotor (pCMV) snabbt tystas i hESCs. Vårt lab har haft god framgång med det mänskliga ubiquitin-C promotor (köns) för att driva uttryck för en dubbel fusion konstruktion i flera rader hESC cell och har observerat minimal signalförlust över tiden.

Sammanfattningsvis innan hESC-derived cellförnyelsen blir kliniskt relevant, måste flera grundläggande biologiska hinder att övervinna - nämligen celldöd eller apoptos efter transplantation av differentierade celler, teratom formation från odifferentierade celler, och avstötning av värdorganismen. Dessa och andra utmaningar belyser behovet för att spåra hESC engraft, överlevnad och spridning inom den mottagande organismen. Utvecklingen av molecular imaging tekniker såsom Firefly luciferas reporter gen och ultra-känsliga CCD-kameror har gjort att icke-invasiva, repetitiva bedömning av cellens läge, migration, proliferation och differentiering in vivo. Sådan teknik kommer att hjälpa driva översättning av hESC biologi från labbet mot kliniska tillämpningar.