The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Japanese was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
Departments of Radiology and Medicine (Cardiology), Stanford University School of Medicine
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 107.20.7.65, User IP: 107.20.7.65, User IP Hex: 1796474689
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (14), e740, doi:10.3791/740 (2008).
ヒト胚性幹細胞（ヒトES）の発見は劇的に再生医療に興味のある医学者が利用できるツールが増えています。しかし、生体に、ヒトES細胞から分化したヒトES細胞、および細胞の直接注入は、これまで顕著な細胞死、奇形腫形成、および宿主の免疫拒絶反応によって妨げられている。移植後のin vivoでヒトES細胞の行動に理解することは新たなイメージング技術は、長手方向にhESCのローカライズ、増殖、および生存率を監視する必要があります。分子イメージングは、調査官の数日、数週間、さらには数ヶ月にわたってin vivoでの細胞増殖に追跡するための、ハイスループットで安価、かつ高感度な手段を与えている。この進歩は著しくhESCの生着、増殖、そして生きている被験者におけるテラトーマ形成の時空間動態の理解を増加している。
分子イメージングにおける大きな進歩は、生体内でのマルチモダリティ画像処理プラットフォームへの分子細胞生物学から非侵襲的なレポーター遺伝子アッセイの拡張となっています。これらのレポーター遺伝子は、宿主細胞の転写機構を利用する人工プロモーターとエンハンサーの制御下、ベクトルおよび非ベクトルの様々な方法を用いて細胞に導入されています。一度セルに、レポーター遺伝子が使用されるプロモーターの種類に応じて、特定の生物学的または細胞の条件の下で恒常的にまたはいずれか一方のみ転写することができます。生理活性タンパク質へのレポーター遺伝子の転写と翻訳は、その後、D -ルシフェリンのような信号を発生するプローブを使用して機密情報、非侵襲的計測機器（例えば、CCDカメラ）で検出される。
蛍光イメージングのために必要とされるin vivoで幹細胞を追跡するために、興奮性、光の必要性を避けるために、生物発光レポーター遺伝子イメージングシステムは、発光を誘導するだけ外因的に投与プローブが必要です。ホタルPhotinusスピラリスから派生したホタルルシフェラーゼは、光学活性代謝物、オキシルシフェリンにD -ルシフェリンを触媒する酵素をコードしている。光学活性を、外部のCCDカメラで監視することができます。安定してレポーターを運ぶ細胞はその染色体DNA内に構築形質レポーターがin vivoでのヒトES細胞の生存や増殖の長手方向の監視を可能にする、娘細胞にDNAを構築渡します。レポーター遺伝子産物の発現は、信号の生成に必要となるためさらに、唯一の現実的親と娘細胞は、生物発光のシグナルを作成します。アポトーシスまたは死細胞はしません。
このビデオでは、生物発光イメージングによる追跡幹細胞の増殖と奇形腫形成に必要な特定の材料および方法について説明する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
PETやMRIなどの他のモダリティに比べて、生物発光は、限られた空間分解能と放出された光子の比較的弱いエネルギー（2-3 eV）のために少なく組織の浸透があり、これらの理由から、それはこれまで大規模な動物には適用されていない。しかし、生物発光は、小動物の追跡生体の幹細胞のためのそれは非常に望ましいこと、低コスト、高スループット、および非侵襲性という利点があります。 PETや蛍光構造などの非生物発光レポーター遺伝子は個々のレポーター遺伝子を含有する別のドメインで構成されている核融合のレポーター遺伝子を作成するためにルシフェラーゼと組み合わせて使用することができます。例えば、私たちのグループは、変動を確認、単量体の赤色蛍光タンパク質（MRFP）、および単純ヘルペスウイルスを含有する融合構築物を使用して小動物の幹細胞の挙動のマルチモダリティの追跡のためにチミジンキナーゼ（TTK、PETレポーター遺伝子を）切り捨てられます。時間が経つにつれて、安定的に統合されたレポーター遺伝子は、内因性染色体の機械による遺伝子サイレンシングの対象となる場合があります。遺伝子サイレンシングへのレポーター遺伝子の感受性は、密接にその発現を駆動するプロモーターの選択に関連している。例えば、サイトメガロウイルスプロモーター（のpCMV）は迅速にヒトES細胞に沈黙される。私たちの研究室は、ダブルフュージョンの発現を駆動するためにヒトユビキチン- Cプロモーター（恥骨）との良好な成功を収めている複数のhESCの細胞株で構築し、時間をかけて最小限の信号損失を観察している。
、分化した細胞の移植後、すなわち細胞死やアポトーシスを未分化細胞からの奇形腫形成、および宿主生物による免疫拒絶反応 - ヒトES細胞由来の細胞の再生が臨床的に関連になる前に結論では、、いくつかの基本的な生物学的ハードルを克服しなければならない。これらおよび他の課題は、宿主内でヒトES細胞の生着、生存、および増殖を追跡するための必要性を強調。このようなホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子と超高感度CCDカメラなどの分子イメージング技術の開発は、セルの位置、移動、増殖、およびin vivoでの分化の非侵襲的、反復的な評価を可能にしました。このような技術が臨床応用に向けて研究室からのhESCの生物学の翻訳をプッシュするのに役立ちます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
ティムドイル博士と生物発光イメージングの支援のためのin vivoイメージングのためのスタンフォードセンターに感謝します。また、マトリックス溶液と幹細胞の共同注射で彼女のテクニックを共有するためのパンガン黄、博士のおかげ。最後に、スティーブのおかげで、博士号を取得してフェルト獣医、動物のケアと支援のための。
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Hyclone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | Stem Cell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth International, Inc | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | Techno Plastic Products | 92006 |
1. Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells 23, 772-780 (2005).
2. Laflamme, M.A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology 25, 1015-1024 (2007).
3. Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture condition. Int J Dev Biol 51, 371-378 (2007).
4. Schulz, T.C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci 4, 27 (2003).
5. Jiang, J., et al. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells 17, 17 (2007).
6. Swijnenburg, R.J., van der Bogt, K.E.A., Sheikh, A.Y., Cao, F. & Wu, J.C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology 18, 38-45 (2007).
7. Herschman, H.R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science 302, 605-608 (2003).
8. Lippincott-Schwartz, J. & Patterson, G.H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science 300, 87-91 (2003).
9. Contag, P.R., Olomu, I.N., Stevenson, D.K. & Contag, C.H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine 4, 245-247 (1998).
10. Bhaumik, S. & Gambhir, S.S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 377-382 (2002).
11. Tisi, L.C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta 457, 115-123 (2002).
12. Ray, P., Tsien, R. & Gambhir, S.S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res 67, 3085-3093 (2007).
13. Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation 113, 1005-1014 (2006).
14. Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells 9, 107-117 (2007).
15. Ray, P., De, A., Min, J.J., Tsien, R.Y. & Gambhir, S.S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res 64, 1323-1330 (2004).
16. Wu, J.C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics 6, 6234-6249 (2006).
17. Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol 11, 514-518 (2001).
18. Mohr, J.C., de Pablo, J.J. & Palecek, S.P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog 22, 825-834 (2006).
19. Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev 14, 378-383 (2005).
20. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells 22, 531-543 (2004).
21. Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R.G. & Thomson, J.A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells 21, 111-117 (2003).
22. Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L. & Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy 10, 1109-1120 (2004).
23. Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells 26, 119-126 (2008).
24. Liew, C.-G., Draper, J.S., Walsh, J., Moore, H. & Andrews, P.W. Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell
