Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Questo protocollo è stato adattato da Lutz et al ^1.

Raccolta ed elaborazione di midollo osseo

1. Isolamento della tibia e femore: eutanasia il mouse donatore e spruzzare le gambe con il 70% di etanolo. Afferrare la caviglia prima saldamente con una pinza smussato e cominciare a tagliare via la pelle e la muscolatura sottostante per esporre la tibia. Per evitare di danneggiare l'osso, tagliato lentamente e in parallelo alla tibia, lasciando intatto il ginocchio.
   
   Per pulire il femore, immobilizzare l'articolazione del ginocchio afferrando con una pinza contundente. Pulire via la muscolatura con un paio di forbici affilate e pinze curve. Continuare verso l'alto fino a quando l'anca è esposto e forbici può essere posizionato tra la testa del femore e dell'anca. Togliere le ossa, tagliando tra comuni femore e dell'anca e del luogo in tampone fosfato (PBS) su ghiaccio.
2. La rimozione del midollo osseo: Pulizia muscolatura residua dalle ossa con le forbici e pinze curve. Tagliare il epifisi di ogni osso e individuare la cavità centrale. Utilizzando una siringa da 10 ml caricato con PBS e un 25G0.5 "ago, a livello del midollo osseo in un non-tessuto piatto rivestito di Petri.
3. L'elaborazione di midollo osseo: Utilizzare l'estremità in gomma dello stantuffo da una siringa da 1 ml per dissociare il midollo osseo in una cella singola sospensione (utilizzare un su e giù, non raschiando movimento). Raccogliere midollo osseo in un tubo conico falco, e risciacquare midollo osseo residuo con PBS.

Coltura di cellule dendritiche

1. Risospendere le cellule in DC media e precursori DC contare su un emocitometro (Figura 1). Vedrete le cellule di varie dimensioni, i precursori DC sono i più grandi e più brillanti. Differenziale contano solo queste cellule. Da due femori e due tibie di una wild-type C57BL / 6 del mouse (6-8 settimane), si dovrebbe aspettare tra 25-40 x 10 ⁶ precursori DC totale.
   
   
   
   Figura 1
   
   
2. Celle di coltura ad una densità di 2 x 10 ⁵ precursori DC / mL in DC dei media integrato con 40 ng / mL ricombinante murino GM-CSF. Cellule piastra in lastre di polistirene non tessuto rivestito di Petri.

Aggiungi media (giorno 3)

Per aggiornare i media, aggiungete la metà del volume totale di mezzi freschi integrata con 40 ng / mL GM-CSF.

Sostituire un terzo della media (giorno 6) e la maturazione

Per aggiornare i media, con attenzione rimuovere un terzo del volume totale dei media e sostituire questo volume con nuove mezzi di comunicazione integrata con DC 40 ng / mL GM-CSF al giorno 6 di cultura.

Se lo si desidera, le cellule dendritiche possono essere stimolati per la maturazione con citochine o toll-like ligandi del recettore. Nel video, DC erano maturate dalla stimolazione durante la notte con 5 ng / ml CpG.

Raccolta di cellule dendritiche

Cultura DC è completa (Figura 2). Cellule saranno sia in sospensione e liberamente aderito alla piastra. Aderito cellule possono essere rimosse raschiando il piatto con un raschietto coltura di tessuti e risciacquo con PBS. Il numero totale di cellule aumenterà 5-8 volte durante la settimana di cultura e il periodo di differenziazione, quindi, si aspettano di raccogliere 1-1,6 x 10 ⁶ cellule / ml.

Figura 2

Reagenti

1. DC dei media
   1. RPMI-1640 mezzi di comunicazione, integrato con:
   2. 10% di siero fetale bovino
   3. 100 UI / ml penicillina
   4. 100 mg / ml streptomicina
   5. 1% di L-glutammina
   6. 0,1% 2-mercaptoetanolo
   7. 1X aminoacidi non essenziali
   8. 1X sodio piruvato
      
2. Ricombinante murino GM-CSF
   1. rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, nessun catalogo. 315-03)

DC sono utili per gli studi di interazioni immune innata e adattativa, e può essere impiegato come vettore di vaccino. In questo video, abbiamo dimostrato i passi per isolare midollo osseo e differenziare cellule dendritiche mieloidi in vitro. Dopo il periodo di coltura, queste cellule possono essere visualizzate sia le cellule al microscopio come aderenti, che spesso possiedono dendriti, e non aderente cellule rotonde. La DC può essere ulteriormente manipolata per la presentazione dell'antigene da pulsante con l'antigene o stimolate per la produzione di citochine e molecole co-stimolatorie upregulation utilizzando citochine e / o toll-like ligandi del recettore (per la revisione, vedere Gilboa, 2008 (2)).