Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Ce protocole a été adapté de Lutz et al. ¹

Récolte et traitement de la moelle osseuse

1. Isolement du tibia et du fémur: Euthanasier la souris donneuse et pulvériser les jambes avec de l'éthanol à 70%. Saisir la cheville premier fermement avec une pince émoussée et de commencer à couper la peau et la musculature sous-jacente pour exposer le tibia. Pour éviter d'endommager l'os, couper lentement et parallèlement au tibia, laissant intact le genou.
   
   Pour nettoyer le fémur, immobiliser l'articulation du genou en saisissant avec une pince émoussée. Nettoyez la musculature avec une paire de ciseaux pointus et pinces courbes. Continuez vers le haut jusqu'à la hanche est exposée et les ciseaux peut être placée entre la tête du fémur et l'articulation de la hanche. Enlever les os en coupant entre les communes du fémur et de la hanche et le placer dans un tampon phosphate salin (PBS) sur la glace.
2. Prélèvement de moelle osseuse: Nettoyer la musculature restant de l'os en utilisant des ciseaux et des pinces courbes. Coupez les épiphyses de chaque os et de localiser la cavité centrale. En utilisant une seringue de 10 ml chargé avec du PBS et une 25G0.5 "aiguille, rincer la moelle osseuse dans un non-tissu boîte de Petri couché.
3. Traitement de la moelle osseuse: Utilisez l'extrémité en caoutchouc du piston d'une seringue 1mL de dissocier la moelle osseuse dans une suspension à cellule unique (utiliser un haut et en bas, ne pas gratter le mouvement). Recueillir la moelle osseuse dans un tube conique faucon, et rincer la moelle osseuse résiduelle avec du PBS.

Culture de cellules dendritiques

1. Resuspendre les cellules dans les médias et le nombre de DC DC précurseurs sur un hématimètre (figure 1). Vous verrez les cellules de tailles diverses, les précurseurs DC sont les plus importants et les plus brillants. Différentiellement compter que ces cellules. De deux fémurs et deux tibias d'un C57Bl type sauvage / 6 de la souris (6-8 semaines), vous devriez vous attendre entre 25-40 x 10 ⁶ précurseurs DC totale.
   
   
   
   Figure 1
   
   
2. Cellules en culture à une densité de 2 x 10 précurseurs DC ⁵ / mL dans des milieux supplémentés avec DC 40 ng / mL recombinante GM-CSF murin. Cellules de la plaque chez les non-tissus enduits des boîtes de Pétri en polystyrène.

Ajouter des médias (jour 3)

Pour actualiser les médias, ajouter la moitié du volume total des milieux frais complété avec 40 ng / ml de GM-CSF.

Remplacer un tiers des médias (jour 6) et la maturation

Pour actualiser les médias, retirez soigneusement tiers du volume total des médias et de remplacer ce volume avec les médias DC frais complété avec 40 ng / ml de GM-CSF au jour 6 de la culture.

Si désiré, les cellules dendritiques peuvent être stimulés à l'aide à la maturation des cytokines ou des ligands du récepteur Toll-like. Dans la vidéo, les PED ont été mûri par la stimulation pendant la nuit avec 5 ng / mL CpG.

Récolte des cellules dendritiques

La culture DC est complète (figure 2). Les cellules seront à la fois en suspension et vaguement adhérer à la plaque. Cellules adhérées peut être enlevé en grattant le plat avec un grattoir culture de tissus et de rinçage avec du PBS. Le nombre total de cellules augmente 5-8 fois pendant la semaine de la culture et la période de différenciation, par conséquent, espérer récolter de 1 à 1,6 x 10 ⁶ cellules / ml.

Figure 2

Réactifs

1. CC des médias
   1. RPMI-1640, complété par:
   2. 10% sérum de veau fœtal
   3. 100 UI / ml de pénicilline
   4. 100 pg / mL de streptomycine
   5. 1% de L-glutamine
   6. 0,1% de 2-mercaptoéthanol
   7. 1X non acides aminés essentiels
   8. 1X pyruvate de sodium
      
2. Recombinant GM-CSF murin
   1. rmGM-CSF (Peprotech inc, au New Jersey, aucun catalogue. 315-03)

PED sont utiles pour les études d'innée et adaptative des interactions immunitaires, et peut être utilisé comme un vecteur vaccinal. Dans cette vidéo, nous avons démontré les étapes pour isoler la moelle osseuse et de différencier les cellules dendritiques myéloïdes in vitro. Après la période de culture, ces cellules peuvent être visualisés au microscope deux cellules comme adhérente, qui possèdent souvent des dendrites, et les cellules rondes non-adhérents. Les PED peuvent encore être manipulées pour la présentation des antigènes par des impulsions avec un antigène ou stimulés pour la production de cytokines et de régulation à la hausse molécule de costimulation utilisant des cytokines et / ou des ligands de récepteurs Toll-like (pour revue, voir Gilboa, 2008 (2)).