Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l'utilisation dans l'imagerie 2-photons

1) Retirer les deux os du fémur d'une souris

1. Utilisez des ciseaux pour couper la dissection musculaire et exposent l'os du fémur dessus et en dessous des articulations (genou et hanche). Saisir le centre du fémur avec des pincettes dissection et coupe au-dessus et en dessous des joints de laisser autant de l'épiphyse intacte que possible.
2. Nettoyez le muscle le plus possible en utilisant des ciseaux de dissection petits. Transfert du fémur dans un plat de RPMI.
3. Toutes les procédures doivent être effectuées dans la hotte partir de ce point, en utilisant uniquement les supports stériles, les instruments, embouts de pipette et des boîtes de culture.

2) Stériliser les os du fémur:

1. Dans la hotte, le transfert des os du RPMI à une boîte de culture de petits remplis avec de l'éthanol à 70% sur la glace.
2. Laisser tremper les os dans de l'éthanol pendant 5 minutes sur la glace.

3) Recueillir de moelle osseuse dans des conditions stériles:

1. Transfert des os dans un plat contenant de la culture de petites filtré stérile primaire des milieux de culture DC.
2. Avec pinces stériles, maintenez l'os sur un plat jeter ou tube, et avec des ciseaux stériles, couper chaque epiphesis (extrémités de l'os) hors tension. La coupe doit exposer la moelle osseuse qui est rouge vif dans le centre de l'os.
3. Avec une seringue stérile (26-28 aiguille de la jauge), sucer jusqu'à environ 100-200 ml de milieu stérile.
4. Tenir l'os avec la pince à épiler stérile sur un plat frais de milieux stériles et insérer l'aiguille dans un côté de l'os. Placez le bout de l'aiguille vers le haut de l'os et l'os lentement laver avec les médias stérile. Si vous êtes dans le centre de l'os, l'aiguille doit glisser facilement.
5. La moelle osseuse délave, soit en petits morceaux ou en une seule pièce. Il devrait être évacuée de l'os et dans le plat de milieux stériles.
6. Répétez cette étape que nécessaire pour laver complètement la moelle de l'os.
7. Lorsque l'os est propre, il sera blanc et translucide.
8. Répétez cette procédure avec l'os du fémur d'autres. Jeter chaque fois le fémur, il est propre.

4) Re-suspendre et centrifuger les cellules de moelle osseuse:

1. Transfert des cellules dans un tube stérile faucon.
2. Si la moelle est encore intact, très doucement la pipette des médias de haut en bas dans le plat, pour briser la moelle dans une suspension cellulaire unique. Cela peut prendre plusieurs minutes et doit être fait lentement pour éviter de tuer les cellules par la force.
3. Centrifuger les cellules comme tout les autres cellules de mammifères.

Lyse cellulaire 5):

1. Retirer le tube de la centrifugeuse après le spin est faite et verser les médias off (décanter) dans un petits déchets (50 ml tube Falcon) dans la hotte.
2. Resuspendre le culot par un léger effleurant le fond du tube.
3. L'utilisation de l'eau stérile filtrée et DPBS 10x ou 10x PBS, réaliser une lyse de l'eau pour enlever les globules rouges (hématies) en utilisant les volumes suivants:
   • 900 ml d'eau stérile filtrée
   • 100 ml DPBS 10x ou 10x PBS
4. Ajouter 100 ml de PBS seconde 10x 5-10 après addition de l'eau. Il est très important ce faire immédiatement afin que seuls les globules rouges sont lysés. C'est une bonne idée d'avoir deux pipettes rempli et prêt.
5. Ajouter 5 ml - 10 ml de milieux stériles cc de base.

6) Nombre de cellules:

1. Dans la hotte, mélanger le ml 6 à 11 de cellules de moelle osseuse en remuant doucement le tube avec une légère inversion, une inclinaison de 45 degrés (non pas pour que les médias touche le haut du tube)
2. Retirer 10 ml de milieu dans un tube stérile pour le comptage.
3. Re-bouchon et centrifuger les cellules à nouveau.

7) Les cellules dendritiques Placage:

1. Les cellules doivent être étalées à une densité de 1 x 106/ml.
2. Retirer les cellules d'une centrifugeuse, des médias décanter et remettre en suspension les cellules dans la quantité appropriée de Media DC primaire pour le placage.
3. Placez dans le tissu de la culture incubateur.

8) Soins de la Culture et de la maturation:

Vérifiez toujours les cultures avant d'ajouter plus de médias ou de l'utilisation de toutes les expériences. Vérifiez l'état de santé générale des cellules et regarder de la contamination potentielle.

Jour 0: Les cellules dendritiques plaqué.

JOUR 3: Suppression de 75% des médias et non adherant cellules et rajouter primaire média DC.

JOUR 6: Après le placage cellule initiale: Re-plaque de cellules en utilisant la procédure suivante:

1. Retirez le support, qui devrait contenir quelques PED non adherant à ce point, et les placer dans un tube stérile Falcon de 50 ml, en laissant des plaques très légèrement humide (vous ne voulez pas les cellules adhérentes à sécher)
2. Ajouter 3 mM EDTA dans PBS dans chaque assiette et laisser reposer pendant 5 minutes.
3. Tenez la plaque à un angle de 45 degrés et délicatement la pipette des médias de haut en bas contre le fond de la plaque en douceur déloger les cellules non adherant.
4. EDTA / PBS devraient devenir plus épaisses cellules sont recueillies en indiquant le bas de laassiette.
5. Après plusieurs minutes de cela, mélange de cellules peuvent être transférées sur le tube Falcon de 50 ml.
6. Spin toutes les cellules après avoir effectué cette procédure pour chaque plaque.
7. Comte et de la plaque des cellules à une densité de 1 x 10 ^ 6 plaque par des médias DC secondaire dans de nouvelles boîtes de culture stérile de 10 cm. Retour aux cellules de culture de tissus incubateur.

JOUR 10-11

PED Mature prête pour une stimulation / antigène de chargement.

9) la stimulation des cellules dendritiques:

1. Utilisez le LPS (lipopolyscaccharide) en combinaison avec le peptide désiré pour l'activation et le chargement des peptides. En fonction de votre source de LPS, les conditions de stimulation différents peut donner de meilleurs résultats. En outre, la quantité désirée de peptide pour la présentation DC doit être optimisée. Conditions de stimulation dans ce protocole ont été de 100 ng / mL et LPS 100 ug / ml OVA (ovalbumine).
2. Antigènes de charge / traiter avec le LPS pendant 18-24 heures avant la récolte / utilisation.

Médias cellules dendritiques: filtre stérile après que tout a été ajouté

S'il vous plaît voir la section de discussion pour un examen des différentes conditions de culture cellulaire dendritique et pour le phénotype des cellules dendritiques qui en résulte. Ces conditions de culture sont conçus pour produire des cellules dendritiques matures qui a rapidement chez les ganglions lymphatiques drainant, 18-24 heures après injection sous-cutanée et l'antigène présent efficace.

Primaire DC médias: filtre stérile après que tout a été ajouté

• 500 ml IMDM (enlever 55 à 60 ml pour un volume final de 500 ml)
• 50 ml de FBS inactivé de la chaleur
• 5 ml de 200 mM de L-Gln, la concentration finale de 2 mM
• 100 UI / ml de pénicilline et 100 mg / mL de streptomycine (5 ml de 10.000 UI / mL Pen et 10 000 mg / mL de stock STREP)
• 50 uM B-Me (14,3 M B-moi de stock, diluer 1:100 dans hotte chimique, utiliser 35 ul par 100 ml de milieu pendant 50 concentration micromolaire)
• 20-30 ng / ml de GM-CSF
• 100-400 UI / mL d'IL-4 d'environ 10 à 40 ng / ml

Les médias SecondaryDC pour la maturation *

100 ng / ml de TNF-alpha (ajouter à DC primaire médias)

* Note: le GM-CSF + IL-4 devrait produire des cellules dendritiques immatures. En utilisant le GM-CSF + IL4 (400 UI / ul) + TNF-alpha (100 ug / ml) va créer des cellules qui ressemblent à maturité des cellules dendritiques dérivées de monocytes. Cellules dendritiques matures sont connues pour ne pas prendre les antigènes de manière aussi efficace que les cellules dendritiques immatures et des cultures endogènes peuvent avoir le TNF-a libéré par les cellules stromales ^4.

Les cellules dendritiques sont des médiateurs clés de la réponse immunitaire adaptative et la cellule d'antigènes les plus efficaces de présenter caractérisé à ce jour. Méthodes pour l'homme et la culture de cellules dendritiques de souris dans la littérature diffèrent par le type de cytokines utilisées pour influencer le développement de différents types de cellules dendritiques. Notamment, le GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, le TNF-alpha et IFN-gamma sont utilisés dans différentes combinaisons pour produire matures, immatures, inflammatoire et l'état d'équilibre comme la moelle osseuse de souris des cellules dendritiques dérivées in vitro de ^3-7. Ici, nous présentons une méthode simple pour la production de cellules dendritiques matures murin qui sont capables de ralliement à ganglions lymphatiques après une injection sous-cutanée, présentant l'antigène et l'activation des cellules T na avez. La population de cellules dendritiques résultant est généralement CD11chigh> 85% avec l'expression inductible de CD80/86 lors de l'activation du LPS. L'ajout de TNF -à la culture le 7 e jour est facultative et produit un phenotype8 plus mature. Le maintien de Langerhans dans les cultures in vitro de cellules dendritiques, le TNF-alpha est un facteur de survie importante mais ne stimule pas les cellules à maturité ^9. Il convient de noter que le TNF-alpha à ​​partir de sources endogènes (probablement les cellules stromales) a été signalé à être présent dans la culture médiatique ^7. D'autres méthodes d'imagerie réussie pour injection sous-cutanée des cellules dendritiques incluent la sélection positive des cellules CD11c + de la rate ainsi que l'étiquetage et à l'activation simultanée de la cellule dendritique endogènes ^{population1, 2, 10.} Production de cellules dendritiques CD11chigh de la moelle osseuse est une méthode robuste qui produit systématiquement un grand nombre de cellules dendritiques capables de présentation des antigènes in vivo, important dans l'imagerie du processus d'activation du système immunitaire adaptatif ^{11, 12.}