The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Max Plank Institute for Molecular Cell Biology and Genetics, Dresden
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Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).
Aquí se presenta la generación de Tre recombinasa a través de las instrucciones, la evolución molecular. Tre recombinasa reconoce una secuencia de destino predefinido dentro de las secuencias LTR del provirus VIH-1, dando lugar a la escisión y la erradicación de la provirus de las células humanas infectadas.
Empezamos con la CRE, una recombinasa de 38 kDa, que reconoce una de 34 pb de doble cadena de secuencias de ADN conocidas como loxP. Debido a Cre pueden eliminar eficazmente las secuencias genómicas, nos propusimos diseñar una recombinación que podrían eliminar la secuencia entre el 5'-LTR y 3'-LTR de un sistema integrado de VIH-1 provirus. Como primer paso se identificaron las secuencias dentro de los sitios LTR que eran similares a loxP y la prueba de actividad de recombinación. Inicialmente Cre y bibliotecas mutagenizadas Cre no se recombinan los sitios elegidos loxLTR del provirus VIH-1. Como el inicio de cualquier proceso de evolución molecular dirigida requiere un mínimo de actividad residual, las secuencias originales asimétrica loxLTR se dividieron en subgrupos y prueba de nuevo para la actividad de recombinación. Actuando como intermediarios, la actividad de recombinación se demostró con los subconjuntos. Bibliotecas A continuación, la recombinasa se enriquecieron a través de ciclos de evolución reiterativo. Posteriormente, las bibliotecas enriquecidas se mezclan y se recombinan. La combinación de diferentes mutaciones resultaron sinérgicos y recombinaciones fueron creadas que fueron capaces de recombinarse loxLTR1 y loxLTR2. Esto se evidencia que una estrategia evolutiva a través de intermediarios puede tener éxito. Después de un total de 126 ciclos de evolución recombinasas individuales funcional y estructuralmente analizados. La recombinasa más activos - Tre - tuvo 19 cambios de aminoácidos en comparación con Cre. Tre recombinado fue capaz de extirpar el provirus VIH-1 del genoma del VIH-1 células HeLa infectadas (ver "el VIH-1 La escisión del ADN proviral uso de una recombinasa Evolved", Hauber J., Heinrich-Pette-Instituto de Virología e Inmunología Experimental, Hamburgo, Alemania). Aunque todavía en sus inicios, la evolución molecular dirigida a permitir la creación de enzimas personalizados que sirven como herramientas de "cirugía molecular" y la medicina molecular.
Dr. Frank Buchholz,
Its nice to listen to the talk. I have some queries about Tre recombinase.,
1, to excise a fragment using cre or tre i guess, there should be two loxp sites if you are targeting HIV LTR region it should be very specific region rather conserved region. So what happens if the LTR regions tend to mutate ?
2, Isn't molecular evolution a long process to create such an recombinase ?
3, There are "zinc finger nuclease" which are custom made enzyme which make specific cuts at DNA. It has the ability to bind to any piece of DNA. So will this technique be useful for making "Zinc Finger Recombinase", which has the ability to bind LTR region and excise the whole or part of HIV genome.
Hoping for your comments
Roshan Padmanabhan
India
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ReplyPosted by: roshanJune 26, 2008, 12:40 PM