The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Max Plank Institute for Molecular Cell Biology and Genetics, Dresden
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Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).
Aqui nós relatamos a geração de Tre recombinase através dirigido evolução, molecular. Tre recombinase reconhece uma seqüência alvo pré-definido dentro das sequências LTR do pró-vírus HIV-1, resultando na excisão e erradicação do provírus de células humanas infectadas.
Começamos com Cre, a recombinase 38 kDa, que reconhece uma seqüência de 34 pb DNA double-stranded conhecido como loxP. Cre porque pode efetivamente eliminar seqüências genômicas, nos propusemos a adaptar um recombinase que poderia remover a seqüência entre o 5'-LTR e 3'-LTR de um provírus HIV-1 integrado. Como uma primeira etapa foram identificadas seqüências dentro dos locais LTR que foram semelhantes aos loxP e testado para a atividade de recombinação. Inicialmente Cre e bibliotecas mutagenizados Cre não recombinar os locais escolhidos loxLTR do pró-vírus HIV-1. Como o início de qualquer processo de evolução molecular dirigida requer, pelo menos, a atividade residual, o original seqüências loxLTR assimétrica foram divididos em subgrupos e testadas novamente para a atividade de recombinação. Atuando como intermediários, a atividade de recombinação foi mostrado com os subconjuntos. Em seguida, bibliotecas recombinase foram enriquecidos por ciclos evolução reiterativa. Posteriormente, as bibliotecas foram enriquecidas embaralhadas e recombinados. A combinação de diferentes mutações provou sinérgicos e recombinases foram criados que foram capazes de recombinar loxLTR1 e loxLTR2. Esta era uma evidência de que uma estratégia evolutiva através de intermediários pode ser bem sucedido. Após um total de 126 ciclos de evolução recombinases individuais foram analisados funcionalmente e estruturalmente. A recombinase mais ativos - Tre - teve 19 mudanças de aminoácidos, em comparação com Cre. Tre recombinase foi capaz de extirpar o provírus HIV-1 a partir do genoma do HIV-1 células infectadas HeLa (ver "HIV-1 DNA proviral Excisão Usando um Recombinase Evolved", Hauber J., Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virologia e Imunologia, Hamburgo, Alemanha). Enquanto ainda em sua infância, dirigido a evolução molecular irá permitir a criação de enzimas personalizadas que servirão como ferramentas de "cirurgia molecular" e medicina molecular.
Dr. Frank Buchholz,
Its nice to listen to the talk. I have some queries about Tre recombinase.,
1, to excise a fragment using cre or tre i guess, there should be two loxp sites if you are targeting HIV LTR region it should be very specific region rather conserved region. So what happens if the LTR regions tend to mutate ?
2, Isn't molecular evolution a long process to create such an recombinase ?
3, There are "zinc finger nuclease" which are custom made enzyme which make specific cuts at DNA. It has the ability to bind to any piece of DNA. So will this technique be useful for making "Zinc Finger Recombinase", which has the ability to bind LTR region and excise the whole or part of HIV genome.
Hoping for your comments
Roshan Padmanabhan
India
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ReplyPosted by: roshanJune 26, 2008, 12:40 PM