In vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen (MES) cellen met behulp van de Opknoping neerzetten

1. Gelatineren T75 fles met behulp van een 0,1% gelatine-oplossing en incubeer plaat in een 37 ° C, 5% CO ₂ weefselkweek incubator 's nachts een dag voor.
2. Haal de MES-cellen van broeden, zuig het medium, spoel de ES-cel-cultuur met PBS, toe te voegen 0,05% trypsine oplossing voor laag de bodem van de schaal (2 ml/100mm plaat).
3. Incubeer bij 37 ° C gedurende ongeveer een minuut, totdat de cellen afstoten van de plaat.
   
4. Voorzichtig vermaal (pipet op en neer) de getrypsiniseerd cellen vier tot zes keer naar de ES-cellen met een aangesloten Pasteur pipet verspreiden,. Breng de verspreide ES-cellen in een 15-ml conische centrifugebuis met voorverwarmde (37 ° C) MES medium.
   
5. Verzamel cellen door centrifugeren. Zuig het supernatant, Voeg 10 ml van MES medium en pipet op en neer om een ​​enkele celsuspensie te vormen.
   
6. Breng de celsuspensie in een T75 fles pre-gecoat met 0,1% gelatine en incubeer bij 37 ° C met 5% CO ₂ voor een uur
   
   * Na een uur, zijn de fibroblasten aan de plaat, maar de stamcellen blijven in het medium. Pipetteer het medium om de stamcellen te verzamelen.
   
   
7. Spin de cellen bij 1000 rpm gedurende 5 minuten en zuig uit de MES medium. Voeg vervolgens nog eens 10 ml van MES differentiatie medium en resuspendeer de cellen door repetitieve pipetteren totdat blijkt dat er een fijne suspensie van cellen.
8. Tellen cellen met een hemocytometer gebruik differentiatie medium om de stamcellen schorsing verdunnen tot een concentratie van 400 tot 500 cellen per 20ul (20ul/drop) in een steriele bekken.
9. Til het deksel voorzichtig omkeren en plaats deze op de top van het schaaltje met 10 ml PBS. Met behulp van een multichannel pipet, maken rijen van 20ul druppels op de up-keerde binnenkant van het deksel van de weefselkweek schotel.
10. Plaats voorzichtig de schaal in de incubator voor 2 dagen. Na twee dagen, voorzichtig draai het bord te dekken, aspiratie 180 ul vers medium differentiatie en doe enkele druppels in de put van een 96-well Ultra-wandplaat. Dan pick-up van de druppel met de pipet en overdracht druppels, een voor een, aan de 96-well plaat. Leg de platen in de incubator ongestoord gedurende 3 dagen.
    
11. Coat elk putje van een 48-well plaat met weefselkweek 300ul van 0,1% gelatine. Na het toevoegen van de gelatine, 's nachts incuberen van de plaat bij 37 ° C een dag van tevoren vóór de overdracht van de Ebs.
    
12. De volgende dag, zuigen de gelatine uit de 48-well plaat. Voeg vervolgens 300 ul van differentiatie medium aan elk putje. Breng de EBS van de platen met 96 putjes om de 48 goed gelatine-gecoate platen een voor een. Verander het medium de volgende dag en wijzigt u vervolgens het medium om de andere dag naar de cellen te behouden.
    
13. Spontane cardiaomyocyte contracties moet blijken binnen 7 dagen.

De nadelen van opknoping drop methode zijn als volgt: de vloeistof volume van een druppel is beperkt tot minder dan 50ul te wijten aan het behoud van opknoping druppels op het deksel door oppervlaktespanning, en het is onmogelijk om het medium te veranderen voor opknoping druppels. Observatie van het vormen van EBS in druppels direct met microscopie is ook zeer moeilijk tijdens de teelt. Verder, de opknoping druppel methode bestaat uit twee stappen, kan daarom een ​​reeks stap van de opknoping drop methode lastig.