ב סימון במבחנה של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור דימות תהודה מגנטית

תיוג מנגן של בתאי גזע עובריים אנושיים

1. Trypsinize נובעת עובריים אנושיים אשר היו בתרבית מזין ללא תנאי למשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת אמצעי התקשורת והתרבות.
2. ספין את התאים על ידי centrifuging בסל"ד 800 במשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מחדש השעיית תא גלולה, לספור את מספר התאים על ידי מכתים trypan כחול. בהתבסס על ספירת התאים המתקבלים, לחלק את התאים לארבע aliquots של 3 מיליון תאים לתוך צינורות חרוטי. גלולה התאים שוב על ידי צנטריפוגה.
3. בדיוק לפני תחילת תיוג מנגן, מנגן כלורי מתמוססים טרי עם פתרון 0.9% נתרן כלוריד לעשות פתרון 0.1mm כלוריד ומגנזיום.
4. על מנת לצפות בערוץ פעילות סידן, ארבע דגימות היו מוכנים. הדוגמה הראשונה היא השליטה שלנו המכיל תאים מודגרות ב 0.9% נתרן כלוריד לבד. המדגם השני מכיל תאים מודגרות מ"מ 0.1 MnCl _2. לדוגמה 3 ו 4 מכילים תאים מודגרות ב 0.1 מ"מ MnCl עם ₂ או 5 מיקרומטר של Ca ^{2 +} ערוץ אגוניסט, (ים )-(-)- מפרץ K8644, או 250 מיקרומטר של Ca ^2, ערוץ ⁺ אנטגוניסט verapamil. דגירה ארבע דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ למשך 30 דקות.
5. לאחר 30 דקות, לסובב את התאים ב 800 סל"ד במשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. ואז לשאוב supernatant לשטוף את התאים שכותרתו פעמיים עם PBS. לאחר כביסה, מחדש להשעות כל גלולה עם 200 PBS μL ולהעביר לתוך צינורות PCR. כדורי אלה הם בדרך כלל לבן.

הברזל תיוג של בתאי גזע עובריים אנושיים

1. מערבבים קליני כיתה סולפט protamine עם מים מזוקקים כדי לקבל 1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות.
2. בתוך שפופרת המכילה אדם בתאי גזע עובריים מדיה, תרבות, להוסיף ferumoxides על 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ואחריו תוספת של 12 מיקרוגרם / סולפט protamine מ"ל. מערבבים את הפתרון נמרצות במשך חמש דקות.
3. הוסף פתרון מעורב לסכום השווה של התקשורת בתרבות התא כדי להשיג ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ferumoxides ו 6 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סולפט protamine לתאי התווית. דגירה תאים בפתרון זה למשך 12 שעות.
4. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, עם לשטוף האחרון המכילה הפרין 10U/ml לפזר את מורכבות תאי ferumoxides-protamine סולפט. לאחר כביסה, trypsinize תאים כדי לקבל השעיה תא בודד.
5. ספירת התאים aliquot למספר הנדרש של דגימות. לאחר כביסה, מחדש להשעות כל גלולה עם 200 PBS μL ולהעביר לתוך צינורות PCR. כדורי אלה צריכים להיות כתום כהה בצבע חום.

ביצוע תהודה מגנטית נייד

1. הפוך רפאים כדי לייצב את צינורות המכילים את כדורי תא וגם כדי למנוע חפצים מהאוויר שמסביב במהלך סריקה. כדי לעשות זאת, תערובת של אגר 0.8% ו -1% של נחושת גופרתית במים מזוקקים ולהביא לרתיחה על ידי במיקרוגל במשך 5-7 דקות. מצננים את התערובת למשך שעה לפחות לפני 1 של סריקה להשיג ג'ל.
2. צינורות המכילים את כדורי תא שכותרתו ממוקמים הפנטום לסריקה. במבחנה הסלולר MRI מבוצעת Signa HDX 3T MRI (GE Medical Systems) באמצעות סליל הברך קליניים.
3. סרוק את התאים שכותרתו מנגן על כל אחד משלושת הדגימות באמצעות הד ספין רצף: TR: זמן החזרה = 800 msec. TE; זמן אקו = מינימום, FOV, שדה הראיה = 12 x 12 ס"מ; מטריצה ​​= 256x256, NEX 1.
4. סרוק את התאים ברזל שכותרתו באמצעות רצף הדרגתי-echo. אנו משתמשים בפרמטרים הבאים עבור הדמיה זו: TR = 100 msec; TE = 10 msec, FA, זווית להעיף = 30 °; FOV = 12 x 12 ס"מ; מטריצה ​​= 256 x 256, NEX 1.

ניתוח תוצאות ה-MRI

1. ניתוח תמונות של MRI בסריקה מתוך 4 מדגמים שונים של תאים מנגן שכותרתו:
   • דוגמה מס '1 היא השליטה שלנו המכיל תאים מודגרות ב 0.9% נתרן כלוריד לבד.
   • דוגמה מס '2 מכיל תאים מודגרות מ"מ 0.1 MnCl _2.
   • לדוגמא # 3 מכיל תאים מודגרות ב 0.1 מ"מ MnCl ₂ עם 5 מיקרומטר של Ca ^{2 +} ערוץ אגוניסט, (ים )-(-)- מפרץ K8644.
   • לדוגמא # 4 מכיל תאים מודגרות ב 0.1 מ"מ MnCl ₂ עם 250 מיקרומטר של Ca ^2, ערוץ ⁺ אנטגוניסט verapamil.
2. כצפוי, ההבדלים בעוצמות אות מתאי שכותרתו מנגן גלויים. בהשוואה לתאי שכותרתו טהורה עם מנגן, את עוצמת האות בצורה ברורה עליות בנוכחות אגוניסט ערוץ הסידן פוחתת בנוכחות של אנטגוניסט תעלות סידן. האזור שבו עוצמת האות גדלה עבור תאים שכותרתו מנגן נמדדים באמצעות תמונה J (NIH, Bethesda, MD, ארצות הברית). התוכנה אותה משמש לניתוח שטח של האות מחוץ תהודה כהה מתאי שכותרתו ברזל. גודל האות האפל של ברזל שכותרתו התאים תלוי במספר התאים או את מספר חלקיקי ברזל הכיל ידי התאים. במקרה זה, 1,000,000 תאים מראה שטח קטן יותר של האות האפל לעומת האות מ 3,000,000 תאים.

תוצאות אלו מצביעות כי אינו מנגן להיכנס דרך ערוץ מתח מגודרת סידן, מנגן יכול לשמש חומר ניגוד MRI, אשר יכול גם להציג את כדאיות התא. לכן, אנו ממליצים מנגן מונחה MRI יכול להיות שימושי כדי לפקח על כדאיות התא לאחר ההשתלה של בתאי גזע עובריים אנושיים לתוך שריר הלב.