В пробирке Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток для магнитно-резонансная томография

Марганец Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток

1. Trypsinize человеческих эмбриональных стебли, которые были культивировали в фидерных свободных условиях в течение 5 минут. Нейтрализовать трипсина путем добавления питательных сред.
2. Спином вниз клетки центрифугированием при 800 оборотов в минуту в течение 5 минут при 20 ° по Цельсию. После повторного приостановления осадок клеток, подсчет числа клеток трипанового синего окрашивания. На основе клеток получены, делятся клетки на четыре порции 3 млн. клеток в конических труб. Гранул клетки снова с помощью центрифугирования.
3. Просто перед началом марганца маркировки, растворить свежий хлористого марганца с 0,9% раствор натрия хлорида, чтобы сделать 0.1мм марганца раствор хлорида.
4. Для того чтобы наблюдать активность кальциевых каналов, четыре образца были готовы. Первая проба нашего контроля, которая содержит клетки инкубировали в 0,9% хлорида натрия в одиночку. Второй образец содержит клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl _2. Пример 3 и 4 содержат клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl ₂ или с 5 мкМ Са ^{2 +-канала} агониста, (S )-(-)- Bay K8644, или 250 мкМ Са ^{2 +-канала} антагонист, верапамил. Инкубируйте четырех образцов при температуре 37 ° по Цельсию с 5% CO ₂ в течение 30 минут.
5. Через 30 минут спином вниз клетки при 800 оборотов в минуту в течение 5 минут при 20 ° по Цельсию. Затем аспирата супернатант и мыть меченых клеток в два раза с PBS. После мытья, вновь приостановить каждая гранула 200 мкл PBS и передачи в пробирки ПЦР. Эти гранулы, как правило, белого цвета.

Железный Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток

1. Смешайте клинико-класса протаминсульфат с дистиллированной водой, чтобы получить 1 мг / мл маточного раствора.
2. В пробирку человеческих эмбриональных стволовых клеток медиа культуры, добавьте ferumoxides на уровне 100 мкг / мл с последующим добавлением 12 мкг / мл протамина сульфата. Смешайте раствор энергично в течение пяти минут.
3. Добавить смешанные решения равное количество средств массовой информации клеточной культуры для достижения конечной концентрации 50 мкг / мл ferumoxides и 6 мкг / мл протамина сульфата на этикетке клеток. Инкубируйте клетки в этом растворе в течение 12 часов.
4. Вымойте клетки дважды с PBS, с последним мыть содержащие гепарин 10U/ml распустить внеклеточной ferumoxides-протамина сульфат комплекса. После мытья trypsinize клетки для получения суспензии отдельных клеток.
5. Граф клетки и аликвоты на необходимое количество образцов. После мытья, вновь приостановить каждая гранула 200 мкл PBS и передачи в пробирки ПЦР. Эти гранулы должны быть темно-оранжевого коричневого цвета.

Выполнение Сотовая Магнитно-резонансная томография

1. Сделать фантом в целях стабилизации пробирки, содержащие ячейки гранул, а также, чтобы избежать артефактов из окружающего воздуха во время сканирования. Для этого смешайте 0,8% агара и 1% медного купороса в дистиллированной воде и довести его до кипения от микроволновой печи в течение 5-7 минут. Прохладный эта смесь, по крайней мере за 1 час до сканирования для достижения гель.
2. Пробирки, содержащие гранулы помечены ячейки помещаются в фантом для сканирования. В пробирке сотовой МРТ проводится при Signa HDx 3Т МРТ (GE Medical Systems) с помощью клинических катушки колена.
3. Сканирование марганца меченых клеток для каждого из трех образцов с помощью последовательности спинового эха: TR; Повторение времени = 800 мсек. TE; Эхо время = минимум, FOV; поле зрения = 12 х 12 см; матрица = 256x256, NEX 1.
4. Сканирование железа меченых клеток, используя градиент-эхо последовательность. Мы используем следующие параметры для этого изображения: TR = 100 мсек, TE = 10 мсек, ФА; флип угол = 30 °; FOV = 12 х 12 см; матрица = 256 х 256, NEX 1.

Анализ результатов МРТ

1. Анализ изображений МРТ с 4 различных образцов марганец-меченых клеток:
   • Пример № 1 нашего контроля, которая содержит клетки инкубировали в 0,9% хлорида натрия в одиночку.
   • Образец № 2 содержит клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl _2.
   • Пример № 3 содержит клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl ₂ с 5 мкМ Са ^{2 +-канала} агониста, (S )-(-)- Bay K8644.
   • Пример № 4 содержит клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl ₂ с 250 мкМ Са ^{2 +-канала} антагонист, верапамил.
2. Как и ожидалось, различия в интенсивности сигнала от марганца меченых клеток видны. По сравнению с клетками меченого чисто с марганцем, интенсивность сигнала заметно увеличивается в присутствии агониста кальциевых каналов и уменьшается в присутствии антагониста кальция канал. Области, где интенсивность сигнала возросла на марганец меченых клеток измеряются с помощью изображения J (NIH, Bethesda, MD, США). То же самое программное обеспечение используется для анализа области темных вне резонансного сигнала от железа меченых клеток. Размер темно сигнал от железа меченых клеток зависит от количества клеток или число частиц железа, содержащиеся клетками. В этом случае, Один миллион клеток показывает меньшую площадь темного сигнала по сравнению с сигналом от трех миллионов клеток.

Эти результаты показывают, что марганец делает войти через напряжения закрытого кальциевых каналов, и марганца может быть использован как МРТ контрастное вещество, которое может также показать жизнеспособность клеток. Таким образом, мы предполагаем, что марганец наведением МРТ может быть полезно для контроля жизнеспособности клеток после трансплантации человеческих эмбриональных стволовых клеток в миокард.