In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Mangan Kennzeichnung von humanen embryonalen Stammzellen

1. Trypsinize der humanen embryonalen stammt, die in Feeder-freien Bedingungen für 5 Minuten wurden kultiviert. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von Nährmedien.
2. Spin down die Zellen durch Zentrifugation bei 800 rpm für 5 Minuten bei 20 ° Celsius. Nach Resuspendieren des Zellpellets, zählen die Anzahl der Zellen durch Trypanblau-Färbung. Basierend auf der Zellzahl erhalten, teilen sich die Zellen in vier Aliquots von 3 Millionen Zellen in konische Rohre. Pellet die Zellen wieder abzentrifugiert.
3. Kurz vor dem Start der Mangan-Kennzeichnung, lösen sich frische Manganchlorid mit 0,9% Natriumchlorid-Lösung, um eine 0,1 Millimeter Manganchloridlösung machen.
4. Um Calcium-Kanal-Aktivität zu beobachten, wurden vier Proben hergestellt. Die erste Probe wird unserer Kontrolle, welche Zellen in 0,9% Natriumchlorid allein inkubiert enthält. Die zweite Probe enthält Zellen in 0,1 mM MnCl ₂ inkubiert. Beispiel 3 und 4 enthalten Zellen in 0,1 mM MnCl ₂ entweder mit 5 uM der Ca ^{2 +-Kanal-Agonisten} inkubiert (S )-(-)- Bay K8644 oder 250 uM der Ca ^{2 +-Kanal-Antagonisten,} Verapamil. Inkubieren Sie die vier Proben bei 37 ° Celsius mit 5% CO ₂ für 30 Minuten.
5. Nach 30 Minuten Spin-Down die Zellen bei 800 rpm für 5 Minuten bei 20 ° Celsius. Dann saugen Sie den Überstand und waschen Sie die markierten Zellen zweimal mit PBS. Nach dem Waschen wieder auszusetzen jedes Pellet mit 200 ul PBS und Überführung in PCR-Röhrchen. Diese Pellets werden in der Regel weiß.

Eisen Kennzeichnung von humanen embryonalen Stammzellen

1. Mix klinisch-grade Protaminsulfat mit destilliertem Wasser zu einer 1 mg / ml Stammlösung erhalten.
2. In ein Röhrchen mit menschlichen embryonalen Stammzellen Kulturmedien, fügen ferumoxides bei 100 ug / ml durch Zugabe von 12 ug / ml Protaminsulfat gefolgt. Mischen Sie die Lösung kräftig für fünf Minuten.
3. Add gemischte Lösung, die gleiche Menge des Zellkulturmedien zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml ferumoxides und 6 pg / mL der Protaminsulfat zu beschriften Zellen zu erreichen. Inkubieren Zellen in dieser Lösung für 12 Stunden.
4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, mit dem letzten Waschschritt mit 10U/ml Heparin an die extrazelluläre ferumoxides-Protaminsulfat komplexen aufzulösen. Nach dem Waschen trypsinize Zellen zu einer einzigen Zelle Suspension zu erhalten.
5. Zählen Sie die Zellen und Aliquot in die erforderliche Anzahl von Proben. Nach dem Waschen wieder auszusetzen jedes Pellet mit 200 ul PBS und Überführung in PCR-Röhrchen. Diese Pellets sollten dunkel orange-braun in Farbe sein.

Performing Cellular Magnetic Resonance Imaging

1. Machen Sie ein Phantom, um die Röhrchen mit den Zellpellets zu stabilisieren und auch Artefakte aus der Umgebungsluft während des Scanvorgangs zu vermeiden. Dazu mischen 0,8% Agar und 1% Kupfersulfat in destilliertem Wasser und bringen es zum Kochen von microwaving für 5-7 Minuten. Coole diese Mischung für mindestens 1 Stunde vor der Abtastung zu einem Gel zu erreichen.
2. Das Röhrchen mit dem markierten Zellpellets werden in dem Phantom für das Scannen platziert. In-vitro-Zell-MRT ist bei Signa HDx 3T-MRT (GE Medical Systems) mit klinischen Kniespule durchgeführt.
3. Scan der Mangan-markierten Zellen für jede der drei Proben mit einem Spin-Echo-Sequenz: TR; Wiederholung Zeit = 800 ms. TE; Echo Zeit = Minimum, FOV; Sichtfeld = 12 x 12 cm; matrix = 256x256, NEX 1.
4. Scan der Eisen-markierten Zellen mit Hilfe eines Gradienten-Echo-Sequenz. Wir verwenden die folgenden Einstellungsmöglichkeiten für den Imaging: TR = 100 ms; TE = 10 ms, FA; Flipwinkel = 30 °; FOV = 12 x 12 cm; Matrix = 256 x 256, NEX 1.

Die Analyse der MRT-Ergebnisse

1. Analysieren Sie Bilder von MRT-Untersuchung von 4 verschiedenen Proben von Mangan-markierten Zellen:
   • Probe Nr. 1 ist unsere steuern, welche Zellen in 0,9% Natriumchlorid allein inkubiert enthält.
   • Probe Nr. 2 enthält Zellen in 0,1 mM MnCl ₂ inkubiert.
   • Probe Nr. 3 enthält Zellen in 0,1 mM MnCl ₂ mit 5 uM der Ca ^{2 +-Kanal-Agonisten} (S )-(-)- Bay K8644 inkubiert.
   • Probe Nr. 4 enthält Zellen in 0,1 mM MnCl ₂ mit 250 uM der Ca ^{2 +-Kanal-Antagonisten,} Verapamil inkubiert.
2. Wie vorhergesagt, sind die Unterschiede in Signalintensitäten aus Mangan markierten Zellen sichtbar. Im Vergleich zu den Zellen rein mit Mangan gekennzeichnet, die Signalintensität deutlich erhöht in Anwesenheit des Calcium-Kanal-Agonist und nimmt in der Anwesenheit von Calcium-Kanal-Antagonisten. Der Bereich, in dem Signalintensität für Mangan markierten Zellen erhöht hat, sind mit Image J (NIH, Bethesda, MD, USA) gemessen. Die gleiche Software ist für die Analyse im Bereich der dunklen off-resonance-Signal aus der Eisen-markierten Zellen verwendet. Die Größe der dunklen Signal aus der Eisen-markierten Zellen hängt von der Anzahl der Zellen oder die Anzahl der Eisenteilchen durch Zellen enthalten. In diesem Fall, Eine Million Zellen zeigt eine kleinere Fläche des dunklen Signal im Vergleich zum Signal von den drei Millionen Zellen.

Diese Ergebnisse zeigen, dass Mangan nicht über den spannungsabhängigen Calcium-Kanal-und Mangan können als Kontrastmittel eingesetzt werden, die auch zeigen können, die die Lebensfähigkeit der Zellen geben. Daher empfehlen wir, dass Mangan-geführten MRT kann hilfreich sein, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen in den Herzmuskel zu überwachen.