L'applicazione di una degenerazione C. elegans Dopamina Saggio Neuron per la convalida dei potenziali morbo di Parkinson geni

A. Costruzione Espressione plasmidi

Due plasmidi sono obbligatori: uno per l'espressione tessuto-specifica del gene di interesse e un secondo come marcatore trasformazione selezionabili (anche se il marcatore plasmide è solitamente disponibile all'interno della comunità di ricerca).

Sperimentale plasmidi

1. Selezionare un promotore che si esprime nel tessuto / cellula tipo di interesse, in questo caso, il trasportatore della DA (Pdat-1) promotore viene utilizzato. Questa espressione plasmide è stato creato come un gateway Invitrogen compatibili con il sistema vettoriale destinazione (pDEST-DAT-1) per consentire l'inserimento di un gene di interesse a valle del promotore di clonazione ricombinazione ^1.
2. Il cDNA del gene di interesse è amplificato mediante PCR utilizzando primers che contengono il Gateway att sequenza B ricombinazione. Il cDNA amplificato viene prima ricombinato in un vettore donatore pDONR201 per creare il vettore di ingresso e poi trasformato in DH5α ceppo di E. coli. A seguito di selezione dei ricombinanti successo e mini-prep isolamento del DNA, il vettore di ingresso viene ricombinato in pDEST-DAT-1 vettore di destinazione per creare il plasmide di espressione. Dettagli sulla clonazione ricombinazione sono disponibili sia dal manuale Gateway Invitrogen o in Caldwell et al. ^5.

Marker selezionabile plasmidi

Un indicatore transgenico plasmide è costituito da un vettore con un promotore di guida l'espressione di una proteina fluorescente in un tessuto ovvio. In questa particolare procedura, l'unc-54 promotore unità espressione ciliegia proteina nel muscolo del corpo parete (Punc-54:: ciliegio).

B. Generazione di transgenici C. elegans tramite microiniezione

Vedi relativi JOVE articolo: http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C. per l'analisi genetica attraversa neurodegenerazione DA

1. I worm sono coltivati ​​utilizzando le procedure standard ^6.
2. Place 10 Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP maschi ^{1, 2} su un piatto di accoppiamento con ermafroditi fase 3-4 L4 transgenici (che esprime Pdat-1:: X gene e Punc-54:: ciliegio) . Questo dovrebbe essere eseguito singolarmente per ciascuna delle tre linee separate stabile creato. Dopo due giorni, togliere i maschi.
3. Ispezionare la generazione F1, se ci sono diversi progenie di sesso maschile, l'accoppiamento ha avuto successo.
4. Clone fuori 5 ermafrodita L4 animali da ogni croce che presentano sia il Pdat-1:: marcatore fluorescente GFP (ereditato dal genitore di sesso maschile) e la Punc-54:: ciliegio muro marcatore fluorescente corpo muscolare (ereditati dal genitore ermafrodita). Gli animali clonati bisogno di essere in fase di L4 per garantire che non hanno ancora accoppiati con animali maschi presenti sulla piastra. Consentire loro di auto-cross e produrre progenie F2.
5. Animali F2 prodotte in fase 3 vengono clonati fuori. In particolare, il trasferimento di animali ~ 5-10 che presentano entrambi i marcatori fluorescenti ai loro piatti individuali. Schermo la generazione F3 per piatti dove il 100% degli animali esprimere GFP in neuroni DA e alcuni degli animali sono espressi ciliegio nel corpo di cellule muscolari della parete. Questi animali saranno omozigoti per la Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: gene GFP mentre stabilmente la trasmissione del transgene appena creato (gene X).

D. dopaminergici Neuron Analisi

1. Preparare un piatto fresco per ciascuna delle tre linee creato in precedenza, così come la Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP solo ceppo. Permettere loro di crescere fino all'età adulta.
2. Trasferimento 30-40 adulti transgenici da ogni riga su un piatto fresco. Permettere loro di porre embrioni per 4 ore a 20 ° C.
3. Rimuovere gli adulti. Permettono di sviluppare gli embrioni per 3-4 giorni a 20 ° C fino a raggiungere la fase di L4.
4. Scegli ~ 100 L4 animali transgenici per un piatto contenente 0,04 mg / ml di 5-fluoro-2'-deossiuridina (FUDR). Questo nucleotide sviluppo analogica blocchi della prossima generazione attraverso l'inibizione della sintesi del DNA, impedendo così la discendenza dalla travolgente animali da esperimento ^7. Proteggere le piastre FUDR dalla luce in quanto è sensibile alla luce.
5. Animali adulti saranno analizzati a diversi giorni dopo la deposizione delle uova. I giorni appropriato di analisi sono determinati empiricamente. Per esempio, abbiamo determinato che il 77%, 87% e il 90% del Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP animali mostrano degenerato neuroni DA nei giorni 6, 7 e 10 di sviluppo post, rispettivamente. Pertanto, se si prevede che il transgene di interesse potrebbero aumentare neurodegenerazione, analizzeremo al giorno 6 e / o 7. Allo stesso modo, transgeni che potrebbero sopprimere neurodegenerazione saranno analizzati a giorni 7 e 10.
6. Fai 4 pastiglie fresca agarosio (a differenza di pastiglie agar la microiniezione, questi vengono utilizzati freschi e non sono autorizzati ad asciugarsi). Ha definito due vetrini da microscopio che hanno un pezzo di nastro attraverso loro, il nastro serve come distanziatore per cuscinetti equivalente di spessore. Lay terzoscivolare tra di loro in panchina (sono posizionati tre al passo). Mettere una goccia di agarosio fuso sul vetrino centro e rapidamente porre un altro scivolo in cima alla agarosio, perpendicolare e in tutti e tre diapositive. Fare alcune pastiglie aggiuntive, lasciando i due scivoli insieme fino a quando il pad è pronto all'uso.
7. Per analizzare verme neuroni DA, posto un calo del 6 ml di 3 levamisolo mM (un anestetico) su un x 22 30 mm di vetro di copertura. Scegli 40 animali adulti (10 in più oltre i 30 ad essere segnati) nella goccia, poi invertire il vetro di copertura sul pad agarosio. Ripetere per ciascuna delle altre linee.
8. Punteggio 30 animali per riga per la presenza di ogni CEP e ADE neurone utilizzando un microscopio composto con epifluorescenza e un cubo filtro che permette la visualizzazione di FITC o GFP. Usiamo un Dotare GFP HYQ filtro cubo (la tecnologia Chroma). Registrare dati sul foglio di punteggio allegata. Wild-type animali mantiene fluorescenza GFP completa in tutti e 4 CEP e 2 neuroni ADE. Singoli animali presentano perdita di neuroni DA vengono segnati come non WT o di "degenerazione". Allo stesso modo, il grado di degenerazione può essere segnata contando i neuroni perdita totale di ogni animale e la popolazione.
9. Ripetere l'analisi altre 2 volte (30 animali più per riga per ogni prova). Il numero totale di vermi espositrici wild-type neuroni DA dai tre turni di analisi è media. L'analisi statistica per la neuroprotezione viene eseguita utilizzando il t di Student-test (p <0,05) per confrontare i vermi di controllo (Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP) con ceppi che l'eccesso di esprimere geni candidati nei neuroni DA .

L'età-dipendente la perdita dei neuroni dopaminergici è una caratteristica clinica del morbo di Parkinson ed è stata associata con l'accumulo o misfolding di una proteina chiamata alfa-sinucleina. Qui mostriamo come etichettare, attraverso un transgene fluorescente, i neuroni dopaminergici di C. elegans e imitare la neurodegenerazione nella malattia di Parkinson da coexpressing umano alfa-sinucleina in queste cellule.

Questo video illustra la metodologia per la crescita, incrocio genetico, montaggio, e il punteggio di nematodi transgenici per valutare i fattori genetici che o migliorare neurodegenerazione o fornire neuroprotezione nel corso dell'invecchiamento. Si ha cura di utilizzo di indicatori per la manutenzione transgene opportunamente messa in scena di sesso maschile e ermafroditi per assicurare il successo incroci genetici, e la coerenza nel notare la perdita dei neuroni o protezione. In questo modo, C. elegans facilita la rapida valutazione di fattori genetici e che possono contribuire alla neurodegenerazione o rappresentare bersagli terapeutici per migliorare la sopravvivenza dei neuroni.