半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳筛选淀粉样蛋白聚合

Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (17), e838, doi:10.3791/838 (2008).

第1部分：准备凝胶

1. 组装凝胶铸造托盘。水平DNA电泳的标准设备都可以使用。对于大量样品，我们准备了一个20厘米× 24厘米，最多四个50梳子板。确保铸坯没有划痕，因为这些扭曲的印迹图像。
2. 创建1X TAE在1.5％琼脂糖溶液（中等或高的凝胶强度，低的平等就业机会）。体积应足以完全淹没梳齿 - 您将要载入尽可能最大限度地提高检测的样品。微波的混合物，直到琼脂糖完全溶解。
3. 快速添加SDS的0.1％，10％的股票。涡流来混合。如果一些琼脂糖凝固在这一步，溶解使用热板和小心，以避免沸腾。
4. 倒入铸造托盘的解决方案。用梳子耙出任何气泡，后来，因为它们可能干扰与传输。
5. 凝胶成立后，除去梳子和凝胶放入凝胶罐。完全淹没在1X TAE凝胶含有0.1％SDS。

第2部分：准备样品

1. 对于高通量分析酵母细胞裂解液中，我们开始成长快速搅拌过夜96块2毫升文化。在这种情况下，每一种文化的高表达有兴趣的蛋白质。分析低丰度蛋白质时，必须使用较大的文化卷
2. 于2000年在室温下5分钟的离心力离心收获细胞。
3. 再次重悬细胞在水和离心机。
4. 悬浮在1毫升spheroplasting溶液。约30分钟的孵育在30 ° C（你可以通过显微镜确认spheroplasting效率）。
5. 在室温下5分钟800离心力离心。完全去除上清液。
6. 在100毫升裂解液重悬沉淀的原生质球。
7. 封面用胶带和2分钟的高速涡块。
8. 2分钟，在4000离心力的颗粒细胞碎片。
9. 小心取出上清液到一个新的容器，例如，一个96孔PCR板。
10. 如果需要，确定的裂解液中的蛋白浓度。
11. 4X样品缓冲液加入样品产生裂解液中含有1X样品缓冲。孵育在室温下5分钟。
12. 负载凝胶。如果需要，可以节省一半的样本量和煮沸SDS - PAGE分析。为了监测转移的程度以后，包括预染SDS - PAGE电泳标记。此外，分子量非常大的蛋白质（例如，鸡胸大肌提取物）组成的标记，可以被用来估计解决复合物的大小。
13. 运行在低电压（≤3 V / cm时的凝胶长度），直到染料前沿到达凝胶月底〜1厘米。这将需要几个小时。重要的是，凝胶保持冷静，否则低分子量蛋白质（例如，单体）的扩散，可以限制他们的检测。
    

第3部分：传输

1. 剪下一块硝化棉凝胶相同的尺寸。
2. 20件GB004和GB002吸墨纸8件，切割凝胶相同的尺寸。削减GB004额外的一块，作为灯芯，它长约20厘米，比凝胶广泛。
3. 沉浸在1X TBS的硝化棉，灯芯，和4件GB002。
4. 在一个塑料容器，组装一叠论文如下：20件干GB004，干GB002 4件，然后一件预湿GB002。栈顶奠定硝化棉。
5. 凝胶在水中的托盘简要铸造冲洗，以除去多余的运行缓冲。然后，仔细地开始滑落到堆栈上的托盘凝胶。托盘滑出凝胶，扑灭膜用TBS必要的。额外的缓冲区，有助于防止气泡被困下的凝胶。一个移液管工程以及用于这一目的。
6. 后凝胶已被移动到堆栈，查深查透的气泡。如果有任何存在，解除凝胶的边缘，并重新申请缓冲区，直到气泡可以算出。
7. 其余三个预湿GB002件放在凝胶顶部。确保坚决整个堆栈的顶部滚动吸管彻底层之间的所有接触。
8. 侧翼转栈包含TBS电视台的两条高架托盘。披风预湿灯芯，灯芯两端是在TBS电视台淹没整个堆栈。
9. 盖上塑料轴承额外的重量（例如，一瓶500毫升的水）的一个额外的托盘组装的转栈。
10. 允许转让进行至少三个小时，或隔夜。
11. 转让后，膜可以处理标准的免疫印迹。

Spheroplasting解决方案
1.2米的D -山梨醇
0.5毫米氯化镁₂
20毫米的Tris，pH值7.5
50 mM的生物医学工程（补充新鲜）
0.5毫克/毫升Zymolyase 100T（补充新鲜）

coration：“裂解液
100毫米的Tris 7.5
50 mM氯化钠
10毫米生物医学工程（补充新鲜）
蛋白酶抑制剂（补充新鲜）

4X采样缓冲器
2X栓塞
20％的甘油
8％SDS
溴酚蓝偏好

SDD - AGE Kryndushkin等人首次报道^1，研究SDS耐配合物[PSI +]朊蛋白在酵母中，至今发现的广泛使用，研究朊病毒和非朊病毒^聚合 2-9 。但是，转移到膜上以下的琼脂糖凝胶电泳的蛋白质是有问题的的，可以在一个扭曲的印迹^图像 5的结果。此外，最常用的淹没electroblotting技术引入实际凝胶的大小限制，因此可处理的样品的数量。我们已经解决了这些问题，由用人向下毛细管^转移 10，一个简单的程序，它使用一摞干印迹文件蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜上。毛细管转移防止失真，并可以轻松地处理大量凝胶。有几件事情之前要考虑使用的SDD年龄。原油样品（例如，裂解液），特定蛋白的免疫检测是必要的。 SDD - AGE不完全变性的蛋白复合体的利益，所以必须承担被检测到的蛋白（S）淀粉样地区以外的抗原表位标记。裂解液可以一般准备，因为他们将一个正常的SDS - PAGE，有两个重要的区别。首先，增加了必须小心，以防止蛋白水解降解。这里使用的部分变性条件是不够的灭活蛋白酶，也可以使靶蛋白更容易水解。至少2倍的推荐浓度使用一个完整的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。其次，加热的样品应避免。如果所有的单体阴性对照需要，例如，以确认高分子量物种得不到应有的共价修饰，一个孵育10分钟，在95 ° C可以使用，这将恢复最淀粉样蛋白单体。

我们感谢西蒙阿尔贝蒂协助发展本议定书。这项工作是支持由来自美国国立卫生研究院（GM25874），霍华德休斯医学研究所的Investigatorship（SL），和美国国家科学基金会predoctoral培训补助金（RH）的补助金。

1. Kryndushkin, D.S., Alexandrov, I.M., Ter-Avanesyan, M.D. & Kushnirov, V.V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).

2. Alexandrov, I.M., Vishnevskaya, A.B., Ter-Avanesyan, M.D. & Kushnirov, V.V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).

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Haitao Zhang

Department of Cell Biology and Molecular Genetics

Microbiology Bldg

University of Maryland

College Park, MD 20742

301 405 0547

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