Скрининг на агрегации амилоида по Полу-денатурирующих моюще-электрофореза в агарозном геле

Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (17), e838, doi:10.3791/838 (2008).

Часть 1: Подготовка гель

1. Соберите лоток гель литья. Стандартное оборудование для горизонтального электрофореза ДНК могут быть использованы. Для большого количества образцов, мы готовим 20 см х 24 см плита с четырьмя 50-а гребни. Убедитесь, что плита не имеет царапин, так как они могут искажать пятно изображения.
2. Создать 1,5% агарозном решение (средний или высокий гель-прочность, низкая РВЗ) в 1X TAE. Объем должен быть достаточно, чтобы полностью погрузить в воду гребень зубы - вы хотите загрузить столько образец, как можно максимально обнаружения. Микроволновая смесь, пока агарозном полностью не растворится.
3. Быстро добавить SDS до 0,1% с 10% акций. Swirl перемешать. Если некоторые агарозном застывает на этом этапе, растворяться использованием горячей плите и будьте осторожны, чтобы избежать кипения.
4. Залейте раствор в литье лоток. Используйте расческу разгребать любые пузыри, так как они в дальнейшем могут помешать передаче.
5. После гель установил, удалить гребни и место гель в гель бак. Полностью погрузиться геля в 1X TAE, содержащем 0,1% SDS.

Часть 2: Подготовка образцов

1. Для высокой пропускной анализ дрожжей лизатов, мы начинаем с 2-мл культуры выращивали в течение ночи с быстрым агитации в 96-и блоков. В этом случае, каждая культура гиперэкспрессией белка интересов. При анализе белков низкого изобилия, больших объемов культура должна быть использована
2. Урожай клетки центрифугированием при 2000 RCF в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Ресуспендируют клетки в воде и центрифуга снова.
4. Ресуспендируют в 1 мл spheroplasting решение. Инкубируйте в течение примерно 30 минут при 30 ° С (Вы можете подтвердить spheroplasting эффективность микроскопия).
5. Центрифуга при 800 RCF в течение 5 мин при комнатной температуре. Полностью удалить супернатант.
6. Ресуспендируют гранулированный сферопластов в 100 мл буфера для лизиса.
7. Крышка блока с лентой и вихря на высокой скорости в течение 2 мин.
8. Гранул распада клеток при 4000 RCF в течение 2 мин.
9. Осторожно удалите супернатант в новый контейнер, например, 96-луночного ПЦР пластины.
10. При необходимости определения концентрации белка лизатов.
11. Добавить 4X буфера образца образцы для получения лизатов содержащие 1X образец буфера. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
12. Нагрузка геля. При желании, сохранить половину объема образца и варить на SDS-PAGE анализа. Для того, чтобы контролировать степень передачи позже, включают предварительно окрашенные SDS-PAGE маркером. Кроме того, маркер молекулярного веса, состоящие из очень большого белки (например, куриные грудной экстракта) может быть использована для оценки размеров решены комплексы.
13. Выполнить при низком напряжении (≤ 3 В / см длины геля) до красителя перед достигает ~ 1 см от конца геля. Это займет несколько часов. Важно, что гель остается прохладным, в противном случае диффузии низкомолекулярных белков весом (например, мономеры) может ограничить их обнаружения.
    

Часть 3: Трансфер

1. Отрежьте кусок нитроцеллюлозы к тому же размеры, как и гель.
2. Сокращение на 20 частей GB004 и 8 частей GB002 промокательной бумаги, к тому же размеры, как и гель. Вырезать дополнительная часть GB004 для использования в качестве фитиля; сделать его примерно на 20 сантиметров шире, чем гель.
3. Погрузите нитроцеллюлозы, фитиль и 4 части GB002 в 1X TBS.
4. В пластиковом контейнере, собрать кипу бумаг следующим образом: 20 штук сухих GB004, то 4 части сухой GB002, то одна часть предварительно мокрой GB002. Положите нитроцеллюлозы на вершине этого стека.
5. Промойте гель на литье лоток кратко в воде, чтобы удалить лишнюю работает буфера. Затем, осторожно начинает скользить гель с лотка в стек. Передвигая гель от лотка, потушить мембраны с TBS по мере необходимости. Дополнительный буфер помогает предотвратить пузыри стать оказавшиеся под гелем. Передачи пипетки хорошо подходит для этой цели.
6. После геля была перемещена в стек, тщательно проверить на пузыри. Если таковые имеются, поднимите край геле и повторно буфер, пока пузырьки могут быть выработаны.
7. Положите оставшиеся три предварительно смачивается GB002 штук на верхнюю часть геля. Достаточная контактов между всеми слоями путем прокатки пипетки твердо в верхней части стека.
8. Пашина передачи стек с двумя лотками содержащие повышенные TBS. Пелерина предварительно мокрой фитиль через стек, что либо конец фитиля погружают в TBS.
9. Обложка собраны передачи стек дополнительный лоток пластмассового подшипника лишний вес (например, 500 мл бутылки воды).
10. Разрешить передачу проводили в течение не менее трех часов, или на ночь.
11. После передачи, мембраны могут быть обработаны стандартной западной промокательной.

Решение Spheroplasting
1,2 М Д-сорбитол
0,5 мМ MgCl ₂
20 мМ Трис, рН 7,5
50 мМ BME (добавить свежие)
0,5 мг / мл Zymolyase 100T (добавить свежие)

coration: подчеркнуть; "> Лизис буфера
100 мМ Трис 7,5
50 мМ NaCl
10 мМ BME (добавить свежие)
ингибиторы протеаз (добавить свежие)

4X буфера Пример
2X ТАЕ
20% глицерина
8% SDS
бромфенола синий со своими предпочтениями

SDD-AGE было впервые сообщено Kryndushkin и соавт. ^1, для изучения SDS-устойчивые комплексы [PSI +] прионов в дрожжах, и с тех пор нашел широкое применение как изучение прионов и не прионных агрегатов ^2-9. Тем не менее, передача белков мембраны следующие электрофореза в геле агарозы проблематично, и может привести к искажению изображения пятно ^5. Кроме того, погруженные electroblotting техника наиболее часто используется вводит практические ограничения на размер геля и, следовательно, количество образцов, которые могут быть обработаны. Мы рассматривали эти проблемы, используя вниз капиллярной передачи ^10, простая процедура, которая использует стек сухого промокательной бумаги передачи белков из геля на нитроцеллюлозные мембраны. Капиллярный перенос предотвращает искажения и позволяет крупным гели для обработки легко. Есть несколько вещей, чтобы рассмотреть, прежде чем использовать SDD-AGE. Для сырой образцы (например, лизатов), иммунодетекции специфических белков необходимо. SDD-AGE не в полной мере денатурации белковых комплексов интерес, поэтому белок (ы) для обнаружения должны нести эпитопа теги вне амилоидогенный регионе. Лизаты в общем случае может быть подготовлен как они были бы для нормального SDS-PAGE, с двумя важными отличиями. Во-первых, увеличилась необходимо соблюдать осторожность, чтобы предотвратить деградацию путем протеолиза. Частично денатурирующих условиях используется здесь не достаточно для инактивации протеиназы, а также может сделать белков-мишеней более восприимчивы к протеолиза. Используйте полный коктейль ингибиторов протеаз по крайней мере в два раза рекомендованной концентрации. Во-вторых, нагревание образцов следует избегать. Если все-мономера отрицательного контроля требуется, например, чтобы подтвердить, что высоким молекулярным весом виды не из-за ковалентные модификации, 10-минутной инкубации при 95 ° С может быть использован, который восстановит самые амилоиды на мономерные белки.

Мы благодарим Саймон Альберти за помощь в разработке этого протокола. Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья (GM25874), Медицинского института Говарда Хьюза Investigatorship (для SL) и Национального научного фонда грант predoctoral обучения (для RH).

1. Kryndushkin, D.S., Alexandrov, I.M., Ter-Avanesyan, M.D. & Kushnirov, V.V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).

2. Alexandrov, I.M., Vishnevskaya, A.B., Ter-Avanesyan, M.D. & Kushnirov, V.V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).

3. Allen, K.D. et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics 169, 1227-1242 (2005).

4. Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C. & Craig, E.A. J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation. The EMBO journal 26, 3794-3803 (2007).

5. Bagriantsev, S.N., Kushnirov, V.V. & Liebman, S.W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology 412, 33-48 (2006).

6. Borchsenius, A.S., Muller, S., Newnam, G.P., Inge-Vechtomov, S.G. & Chernoff, Y.O. Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase. Current Genetics 49, 21-29 (2006).

7. Salnikova, A.B., Kryndushkin, D.S., Smirnov, V.N., Kushnirov, V.V. & Ter-Avanesyan, M.D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).

8. Tank, E.M., Harris, D.A., Desai, A.A. & True, H.L. Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability. Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).

9. Douglas, P.M. et al. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 7206-7211 (2008).

10. Nagy, B., Costello, R., and Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).

10 Comments

Haitao Zhang

Department of Cell Biology and Molecular Genetics

Microbiology Bldg

University of Maryland

College Park, MD 20742

301 405 0547

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.