세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (17), e838, doi:10.3791/838 (2008).

1 부 : 겔 준비

1. 겔 주조 트레이를 조립. 수평 DNA 전기 영동 표준 장비를 사용할 수 있습니다. 샘플 많은 경우, 우리는 최대 4 개의 50 - 잘 빗과 함께 X 24cm 슬래브 20cm를 준비합니다. 이들은 얼룩 이미지를 왜곡 수 슬래브가 흠집이없는 있는지 확인하십시오.
2. 1X 태의 1.5 % 아가로 오스 솔루션 (중간 또는 높은 겔 강도, 낮은 EEO)를 만듭니다. 볼륨 완전히 잠수함 빗 치아를 충분히해야합니다 - 당신은 검색을 최대화하기 위해 가능한 한 많은 예제를로드하는 것이 좋습니다. 마이크로 웨이브는 혼합물은 아가로 오스는 완전히 녹아 때까지.
3. 신속하게 10 %의 주식의 0.1 %에 SDS를 추가합니다. 섞어 소용돌이. 일부 아가로 오스는이 단계 동안 굳은 경우, 뜨거운 접시를 사용하여 redissolve하고 끓는 않도록주의하십시오.
4. 캐스팅 트레이에 솔루션을 하거라. 그들이 나중에 전송을 방해할 수있는 것처럼 언제 거품이 밖으로 경사각에 빗을 사용합니다.
5. 젤 설정한 후, 빗을 제거하고 겔 탱크에 젤 넣습니다. 완전 잠수함 1X 태에서 젤은 SDS 0.1 %를 포함.

2 부 : 준비 샘플

1. 효모 lysates의 높은 처리량 분석을 위해, 우리는 96 블록에 잘 급속한 동요와 하룻밤 성장 2 - ML 문화로 시작합니다. 이 경우, 각 문화는 overexpressing 관심의 단백질이다. 낮은 풍부한 단백질을 분석하면, 더 큰 문화 볼륨을 사용해야합니다
2. 상온에서 5 분 2000 RCF에서 원심 분리하여 세포를 수확.
3. 다시 물, 원심 분리기에서 세포를 Resuspend.
4. 1 ML spheroplasting 솔루션 Resuspend. 30 약 30 분 품어 ° C (당신은 현미경으로 spheroplasting 효율성을 확인 수 있습니다.)
5. 상온에서 5 분 800 RCF에서 원심 분리기. 완전히 뜨는 제거합니다.
6. 100 ML의 용해 버퍼 pelleted spheroplasts을 Resuspend.
7. 테이프 2 분 고속에 소용돌이와 함께 블록을 커버.
8. 2 분 4,000 RCF에서 펠렛 셀룰러 잔해.
9. 조심스럽게 새로운 용기, 예를 들어, 96 - 웰 플레이트 PCR에 뜨는 제거합니다.
10. 원하는 경우, lysates의 단백질 농도를 결정한다.
11. 1X 샘플 버퍼를 포함하는 lysates를 생성하는 샘플에 4X 샘플 버퍼를 추가합니다. 상온에서 5 분 알을 품다.
12. 젤을로드합니다. 원하는 경우, 샘플 볼륨의 절반을 저장하고 SDS - PAGE 분석을 위해 끓여. 나중에 양도의 범위를 모니터하기 위해, 사전에 묻은 SDS - PAGE 마커를 포함합니다. 또한, 매우 큰 단백질 (예, 닭고기 pectoralis 추출)로 구성된 분자량 마커가 해결 단지의 크기를 추정하는 데 사용할 수 있습니다.
13. 염료 앞에는 젤의 끝에서 ~ 1cm에 도달할 때까지 저전압 (≤ 3 V / cm 겔 길이)에서 실행합니다. 이것은 몇 시간이 소요됩니다. 젤 시원한 유지하는 것이 중요합니다, 그렇지 않으면 낮은 분자량의 단백질 (예 : 단량체)의 확산들은 검색을 제한할 수 있습니다.
    

파트 3 : 전송

1. 젤 같은 크기로 nitrocellulose의 한 조각을 잘라 버릴거야.
2. 젤 같은 크기로 GB004 20 조각과 GB002 압지 8 조각을 잘라 버릴거야. 심지로 사용될 GB004의 추가 부분을 잘라, 겔보다 약 20 cm 폭을합니다.
3. 1X TBS에서 nitrocellulose, 심지, 그리고 GB002 4 조​​각을 담가.
4. 마른 GB004 20 조각, 다음 마른 GB002 4 조​​각, 다음 사전 서부 유럽 표준시 GB002 중 하나 조각 : 플라스틱 용기에, 다음과 같이 서류의 스택을 조립. 이 스택의 상단에있는 nitrocellulose 있다고 믿는다.
5. 초과 실행 버퍼를 제거하는 물에 캐스팅 트레이 간략에서 젤 린스. 그런 다음, 조심스럽게 스택에 트레이에서 젤 슬라이드 시작합니다. 트레이에서 젤 슬라이딩 있지만, 필요에 따라 TBS와 멤브레인을 줄여봐. 추가 버퍼 젤 아래에 갇혀되는 것을 거품을 방지하는 데 도움이됩니다. 전송 피펫이 목적을 위해 잘 작동합니다.
6. 젤이 스택으로 이동되었습니다 후, 거품에 대해 철저히 확인하십시오. 어떤이있는 경우, 젤의 가장자리를 채취해서 거품이 해낼 수있을 때까지 버퍼를 다시 적용합니다.
7. 젤 위에 나머지 세 미리 침수 GB002 조각을 넣어. 단단히 스택의 맨 위에 피펫 롤링하여 모든 레이어 간의 접촉을 철저히 보장합니다.
8. TBS 담긴 두개의 높은 쟁반과 플렝크 전송 스택을. 심지의 양쪽 끝에이 TBS에 빠져들 것입니다 이러한 스택에 걸쳐 사전 서부 유럽 표준시 심지를 드레이프.
9. 추가 무게를 (예, 물 500 ML 병) 베어링 추가 플라스틱 트레이로 조립 전송 스택을 커버.
10. 세 시간이나 밤새 최소 진행 전송을 허용합니다.
11. 전송 후, 멤브레인 표준 양식은 모래 바닥으로 처리할 수 있습니다.

Spheroplasting 솔루션
1.2 M D - sorbitol
0.5 MM MgCl ₂
20 MM 트리스, 산도 7.5
50 MM의 BME (신선 추가)
0.5 MG / ML Zymolyase 100T는 (신선한 추가)

coration : 밑줄; "> 용해 완충액
100 MM 트리스 7.5
50 MM NaCl
10 MM BME는 (신선한 추가)
단백 분해 효소 억제제는 (신선한 추가)

4X 샘플 버퍼
2X 태
20 % 글리세롤
8퍼센트 SDS
취향에 bromophenol 블루

SDD - AGE 먼저 Kryndushkin 외 의해보고되었다. ^1, SDS 방지 단지 공부를 [PSI +] 효모의 프리온, 이후 프리온이 아닌 프리온 집계 ^2-9 모두를 공부하고 널리 사용 발견했습니다. 그러나, 아가로 오스 겔에서 막 다음 전기 영동으로 단백질의 양도 문제이며, 왜곡된 얼룩 이미지 ⁵ 발생할 수 있습니다. 또한, 가장 일반적으로 사용하는 잠수 electroblotting 기술은 젤의 크기에 대한 실질적인 제한을 도입하기 때문에 처리할 수 샘플의 수입니다. 우리는 아래로 모세 전송 ^10, 겔에서 nitrocellulose 막에 단백질을 전송 마른 모래 바닥 논문의 스택을 사용하는 간단한 절차를 채용하여 이러한 문제를 해결했습니다. 모세관 전송 왜곡을 방지하고 대형 젤 쉽게 처리할 수 있습니다. SDD - AGE를 사용하기 전에 고려해야 할 몇 가지가 있습니다. 원유 샘플 (예 : lysates), 특정 단백질의 면역이 필요합니다. SDD - 나이가 충분히 관심의 단백질 단지를 변성하지 감지하는 단백질 (들)은 amyloidogenic 지역 이외의 에피토프 태그를 부담합니다 그럼. 그들이 정상적인 SDS - PAGE를위한 것입니다 같은 Lysates는 일반적으로 두 가지 중요한 차이점으로 준비하실 수 있습니다. 첫째, proteolysis에 의해 저하를 방지하기 위해 증가주의 이동합니다. 여기에 사용되는 부분 denaturing 조건은 프로 테아제를 inactivate에 충분하지 않은, 또한 proteolysis에 타겟 단백질이 더 취약 할 수 있습니다. 적어도 두 배 권장 농도에서 전체 테아제 억제제 칵테일을 사용합니다. 둘째, 샘플을 피해야한다 가열. 모든 단량체 음성 컨트롤이 필요한 경우, 예를 들어 높은 분자 - 중량 종은 monomeric 단백질 가장 amyloids를 복원하는 것입니다 공유 결합 수정, 95에서 10 분 배양 ° C를 사용할 수로 인해하지 않는지 확인합니다.

우리는이 프로토콜을 개발과 지원 사이먼 Alberti 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (GM25874), 하워드 휴즈 의학 연구소 Investigatorship (SL)을, 그리고 국립 과학 재단 predoctoral 훈련 부여 (RH)을에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. Kryndushkin, D.S., Alexandrov, I.M., Ter-Avanesyan, M.D. & Kushnirov, V.V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).

2. Alexandrov, I.M., Vishnevskaya, A.B., Ter-Avanesyan, M.D. & Kushnirov, V.V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).

3. Allen, K.D. et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics 169, 1227-1242 (2005).

4. Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C. & Craig, E.A. J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation. The EMBO journal 26, 3794-3803 (2007).

5. Bagriantsev, S.N., Kushnirov, V.V. & Liebman, S.W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology 412, 33-48 (2006).

6. Borchsenius, A.S., Muller, S., Newnam, G.P., Inge-Vechtomov, S.G. & Chernoff, Y.O. Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase. Current Genetics 49, 21-29 (2006).

7. Salnikova, A.B., Kryndushkin, D.S., Smirnov, V.N., Kushnirov, V.V. & Ter-Avanesyan, M.D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).

8. Tank, E.M., Harris, D.A., Desai, A.A. & True, H.L. Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability. Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).

9. Douglas, P.M. et al. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 7206-7211 (2008).

10. Nagy, B., Costello, R., and Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).

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Haitao Zhang

Department of Cell Biology and Molecular Genetics

Microbiology Bldg

University of Maryland

College Park, MD 20742

301 405 0547

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