הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג'ל

Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (17), e838, doi:10.3791/838 (2008).

חלק 1: הכנת ג'ל

1. להרכיב את מגש הליהוק ג'ל. ציוד סטנדרטי עבור אלקטרופורזה DNA אופקי יכול לשמש. עבור מספר גדול של דגימות, אנו מכינים 20 ס"מ X 24 ס"מ לוח עם עד ארבעה 50-היטב מסרקים. ודא הלוח אין שריטות, כמו אלה יכולים לעוות את התמונה כתם.
2. יצירת פתרון 1.5% agarose (בינונית או גבוהה ג'ל חוזק, EEO נמוך) ב 1X טה. הנפח צריך להיות מספיק כדי לצלול לחלוטין את השיניים מסרק - אתה רוצה לטעון מדגם ככל האפשר על מנת למקסם את הזיהוי. מיקרוגל התערובת עד agarose הוא נמס לגמרי.
3. להוסיף במהירות SDS עד 0.1% מן המניות של 10%. מערבולת לערבב. אם agarose כמה מבצרת במהלך שלב זה, redissolve באמצעות צלחת חמה להיזהר רותחים.
4. יוצקים את הפתרון למגש הליהוק. שימוש במסרק לרוקן את כל הבועות, כפי שהם יכולים מאוחר יותר להפריע ההעברה.
5. לאחר ג'ל קבע, להסיר מסרקים והמקום הג'ל לתוך הטנק ג'ל. לחלוטין את ג'ל 1X טה לצלול המכיל 0.1% SDS.

חלק 2: הכנת דוגמאות

1. ניתוח תפוקה גבוהה של lysates שמרים, אנחנו מתחילים עם 2-ml תרבויות גדל לילה טוב 96-חוסם עם תסיסה מהירה. במקרה זה, כל תרבות היא overexpressing חלבון של עניין. בניתוח חלבונים בשפע נמוך, תרבות כרכים גדולים יש להשתמש
2. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב RCF 2000 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. Resuspend תאים מים צנטריפוגות שוב.
4. Resuspend בפתרון 1 מ"ל spheroplasting. דגירה של כ -30 דקות ב -30 ° C (אתה יכול לאשר את היעילות spheroplasting ידי מיקרוסקופית).
5. צנטריפוגה ב RCF 800 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר לחלוטין supernatant.
6. Resuspend spheroplasts pelleted במאגר 100 מ"ל תמוגה.
7. מכסים את הבלוק עם קלטת מערבולת על מהירות גבוהה במשך 2 דקות.
8. גלולה הסלולר פסולת בבית RCF 4000 דקות 2.
9. מוציאים בזהירות supernatant למיכל חדש, למשל, גם צלחת 96-PCR.
10. אם תרצה, תוכל לקבוע את הריכוז של חלבון lysates.
11. הוסף חוצץ מדגם 4X את דגימות כדי ליצור lysates המכיל 1X חיץ המדגם. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
12. טען ג'ל. אם תרצה, תוכל לחסוך חצי נפח מדגם להרתיח אותו לניתוח SDS-PAGE. על מנת לנטר את מידת העברת מאוחר יותר, כוללים מראש מוכתם SDS-PAGE הסמן. בנוסף, סמן משקל מולקולרי המורכב של חלבונים גדולים מאוד (למשל, עוף הפקטוראלי לחלץ) יכול לשמש כדי להעריך גודל של מתחמי נפתרה.
13. הפעלה במתח נמוך (3 ≤ V / ס"מ אורך ג'ל) עד ​​הכניסה לצבוע מגיע ~ 1 ס"מ מהקצה של הג'ל. זה ייקח כמה שעות. חשוב הג'ל להישאר רגוע, אחרת דיפוזיה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך (לדוגמה, מונומרים) יכול להגביל את גילוי שלהם.
    

חלק 3: העברת

1. חותכים פיסת nitrocellulose לממדי כמו הג'ל.
2. חותכים 20 חתיכות של GB004 ו -8 פיסות נייר סופג GB002, לממדי כמו הג'ל. חותכים חתיכה נוספת של GB004 לשמש הפתיל; לעשות את זה על 20 סנטימטרים יותר מאשר הג'ל.
3. לטבול את nitrocellulose, פתילה, ו 4 חתיכות של GB002 ב 1X כפות.
4. במיכל פלסטיק, להרכיב את ערימת ניירות כדלקמן: 20 חתיכות של GB004 יבש, אז 4 חתיכות של GB002 יבש, אז חתיכה אחת של GB002 מראש רטוב. הנח את nitrocellulose על גבי זה בערימה.
5. שוטפים את הג'ל על בקצרה את מגש הליהוק במים כדי להסיר את החיץ פועל עודף. ואז, בזהירות מתחילים להחליק את הג'ל את המגש על הערימה. אמנם החלקת ג'ל את המגש, לכבות את הממברנה עם כפות לפי הצורך. חיץ נוסף עוזר למנוע בועות מלהפוך לכודים תחת הג'ל. פיפטה להעביר עובד היטב למטרה זו.
6. לאחר ג'ל הועברה מחסנית, לבדוק ביסודיות על בועות. אם יש כאלה, להרים את קצה הג'ל ולהחיל מחדש חוצץ עד בועות יכול להיות עבד החוצה.
7. שמים את יתרת three מראש הרטובות GB002 חתיכות על גבי הג'ל. ודא קשר יסודי בין כל השכבות על ידי גלגול פיפטה בחוזקה לרוחב החלק העליון של המחסנית.
8. הצלע מחסנית העברה עם שני מגשים גבוהות המכיל כפות. לכסות את הפתיל מראש רטוב על פני מחסנית כזו או סוף הפתיל הוא שקוע כפות.
9. מכסים את הערימה העברת התאספו עם מגש פלסטיק נוספת נושאת משקל נוסף (למשל, בקבוק 500 מ"ל מים).
10. אפשר להמשיך להעביר מינימום של שלוש שעות, או למשך הלילה.
11. לאחר ההעברה, הקרום יכול להיות מעובד על ידי תקן המערבי סופג.

Spheroplasting פתרון
1.2 מ 'ד סורביטול
0.5 mM MgCl ₂
20 מ"מ טריס, pH 7.5
BME 50 מ"מ (להוסיף טרי)
0.5 מ"ג / מ"ל ​​Zymolyase 100T (להוסיף צח)

coration: להדגיש: "> תמוגה הצפת
100 מ"מ טריס 7.5
50 mM NaCl
10 mM BME (להוסיף צח)
מעכבי פרוטאז (להוסיף צח)

לדוגמא 4X הצפת
טה 2X
20% גליצרול
8% SDS
כחול bromophenol להעדפה

SDD-AGE דווח לראשונה על ידי Kryndushkin et al. ^1, ללמוד SDS עמידים קומפלקסים של [PSI +] הפריון של שמרים, ומצא כי השימוש הנרחב ללמוד הן הפריון ואת הפריון הלא אגרגטים ^2-9. עם זאת, העברה של חלבונים כדי אלקטרופורזה קרום הבאים ג'ל agarose הוא בעייתי, והוא יכול להביא תמונה כתם מעוות ^5. בנוסף, טכניקה electroblotting שקוע הנפוץ ביותר מציג מגבלות מעשיות בגודל של הג'ל ולכן מספר דגימות כי יכול להיות מעובד. אנחנו צריכים לטפל בבעיות אלה על ידי המעסיק להעביר נימי כלפי מטה ^10, הליך פשוט אשר משתמשת ערמת ניירות סופג יבש להעברת חלבונים מן הג'ל על קרום nitrocellulose. העברת נימי מונע עיוות ומאפשר ג'לים גדול להיות מעובד בנקל. יש כמה דברים לשקול לפני השימוש SDD-AGE. לקבלת דוגמיות גולמי (למשל, lysates), immunodetection של חלבונים מסוימים הוא הכרחי. SDD-AGE אינו מלא לפגל קומפלקסים חלבונים של עניין, כל כך את החלבון (ים) כדי להתגלות חייב לשאת תג epitope מחוץ לאזור amyloidogenic. Lysates יכולים בדרך כלל להיות מוכנים כפי שהם היו להיות נורמלי SDS-PAGE, עם שני הבדלים חשובים. ראשית, הטיפול חייב להילקח מוגברת כדי למנוע השפלה ידי proteolysis. התנאים חלקית denaturing משמש כאן אינם מספיקים כדי להשבית פרוטאזות, והוא יכול גם לייצר חלבונים היעד רגישים יותר proteolysis. השתמש קוקטייל להשלים מעכבי פרוטאז בריכוז לפחות כפולה מומלץ. שנית, חימום הדגימות יש להימנע. אם פקד כל מונומר שלילי הרצויה, למשל כדי לאשר גבוהה מולקולרית משקל מינים שאינם בשל שינויים קוולנטיים, דגירה של 10 דקות בשעה 95 ° C יכול לשמש, אשר תשחזר ביותר amyloids לחלבון monomeric.

אנו מודים סיימון אלברטי לסיוע בפיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי (GM25874), הווארד יוז רפואי Investigatorship המכון (ל SL), וכן הקרן הלאומית למדע מענק predoctoral הכשרה (עד ר"ה).

1. Kryndushkin, D.S., Alexandrov, I.M., Ter-Avanesyan, M.D. & Kushnirov, V.V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).

2. Alexandrov, I.M., Vishnevskaya, A.B., Ter-Avanesyan, M.D. & Kushnirov, V.V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).

3. Allen, K.D. et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics 169, 1227-1242 (2005).

4. Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C. & Craig, E.A. J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation. The EMBO journal 26, 3794-3803 (2007).

5. Bagriantsev, S.N., Kushnirov, V.V. & Liebman, S.W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology 412, 33-48 (2006).

6. Borchsenius, A.S., Muller, S., Newnam, G.P., Inge-Vechtomov, S.G. & Chernoff, Y.O. Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase. Current Genetics 49, 21-29 (2006).

7. Salnikova, A.B., Kryndushkin, D.S., Smirnov, V.N., Kushnirov, V.V. & Ter-Avanesyan, M.D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).

8. Tank, E.M., Harris, D.A., Desai, A.A. & True, H.L. Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability. Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).

9. Douglas, P.M. et al. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 7206-7211 (2008).

10. Nagy, B., Costello, R., and Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).

10 Comments

Haitao Zhang

Department of Cell Biology and Molecular Genetics

Microbiology Bldg

University of Maryland

College Park, MD 20742

301 405 0547

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.