अर्ध denaturing डिटर्जेंट - agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा Amyloid एकत्रीकरण के लिए स्क्रीनिंग

Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (17), e838, doi:10.3791/838 (2008).

भाग 1: जेल की तैयारी

1. जेल कास्टिंग ट्रे इकट्ठा. क्षैतिज डीएनए वैद्युतकणसंचलन के लिए मानक उपकरण का इस्तेमाल किया जा सकता है. नमूनों की बड़ी संख्या के लिए, हम एक 20 सेमी x 24 सेमी करने के लिए चार 50-अच्छी तरह कंघी के साथ स्लैब तैयार करते हैं. यकीन है कि स्लैब खरोंच नहीं है, के रूप में इन धब्बा छवि को विकृत कर सकते हैं.
2. 1X TAE में एक 1.5% agarose समाधान (मध्यम या उच्च जेल शक्ति, कम EEO) बनाएँ. मात्रा पूरी तरह से कंघी दांत डूब के लिए पर्याप्त होना चाहिए - आप जितना संभव हो उतना नमूना लोड करने के लिए पता लगाने को अधिकतम करना चाहते हैं जाएगा. माइक्रोवेव मिश्रण जब तक agarose पूरी तरह भंग है.
3. तेजी से एक 10% शेयर से 0.1% करने के लिए एसडीएस जोड़ने. मिश्रण भंवर. यदि इस कदम के दौरान कुछ agarose solidifies, एक गर्म थाली का उपयोग redissolve और उबलते से बचने के लिए सावधान रहना.
4. कास्टिंग ट्रे में समाधान डालो. रैक किसी भी बुलबुले बाहर कंघी, प्रयोग के रूप में वे बाद में हस्तांतरण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है.
5. जेल के बाद की स्थापना की है, कंघी को हटाने और जेल टैंक में जेल जगह है. पूरी तरह से डूब 1X TAE में जेल 0.1% युक्त एसडीएस.

भाग 2: तैयारी नमूने

1. उच्च throughput खमीर lysates के विश्लेषण के लिए, हम 2 मिलीलीटर तेजी से आंदोलन के साथ रात 96 अच्छी तरह से ब्लॉक में हो संस्कृतियों के साथ शुरू करते हैं. इस मामले में, प्रत्येक संस्कृति overexpressing ब्याज की एक प्रोटीन होता है. जब कम बहुतायत प्रोटीन का विश्लेषण, बड़ा संस्कृति मात्रा इस्तेमाल किया जाना चाहिए
2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2000 आरसीएफ पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं हार्वेस्ट.
3. पानी और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं को फिर से Resuspend.
4. 1 मिलीलीटर spheroplasting समाधान में Resuspend. 30 में लगभग 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस (आप माइक्रोस्कोपी द्वारा spheroplasting दक्षता की पुष्टि कर सकते हैं).
5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 आरसीएफ अपकेंद्रित्र. पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
6. 100 मिलीलीटर lysis बफर में pelleted spheroplasts Resuspend.
7. टेप और 2 मिनट के लिए उच्च गति पर भंवर के साथ ब्लॉक कवर.
8. 2 मिनट के लिए 4000 आरसीएफ पर गोली सेलुलर मलबे.
9. ध्यान से एक नई कंटेनर, उदाहरण के लिए, एक 96 - अच्छी तरह से पीसीआर थाली सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
10. अगर वांछित, lysates के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण.
11. नमूने के लिए 4X नमूना बफर जोड़ें 1X नमूना बफर युक्त lysates उत्पन्न. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
12. जेल लोड. अगर वांछित, नमूना मात्रा के आधे से बचाने और यह एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए फोड़ा. आदेश में हस्तांतरण की हद पर नजर रखने के लिए बाद में, एक पूर्व दाग मार्कर एसडीएस पृष्ठ शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, एक आणविक वजन बहुत बड़े प्रोटीन (जैसे, चिकन pectoralis निकालने) के मिलकर मार्कर हल परिसरों के आकार का अनुमान किया जा सकता.
13. डाई सामने जेल के अंत से ~ 1 सेमी तक पहुँचता है जब तक कम वोल्टेज (≤ 3 जेल / वी सेमी लंबाई) पर चलाएँ. यह कई घंटे लग जाएगा. यह महत्वपूर्ण है कि जेल शांत रहना है, अन्यथा कम आणविक भार प्रोटीन (जैसे, monomers) के प्रसार को अपनी सीमा का पता लगाने सकता है.
    

भाग 3: स्थानांतरण

1. जेल के रूप में एक ही आयामों को nitrocellulose का एक टुकड़ा कट.
2. जेल के रूप में एक ही आयामों को GB004 के 20 टुकड़े और GB002 स्याहीचट के 8 टुकड़े, काटें. एक बाती के रूप में इस्तेमाल किया जा GB004 के एक अतिरिक्त टुकड़ा कट, यह के बारे में 20 सेंटीमीटर जेल से व्यापक बनाने.
3. Nitrocellulose, बाती, 1X TBS में और GB002 की 4 गोटियां विसर्जित कर दिया.
4. GB004 सूखी के 20 टुकड़े, तो सूखी GB002 के 4 टुकड़े, तो पूर्व गीला GB002 का एक टुकड़ा: एक प्लास्टिक कंटेनर में, के रूप में कागज के एक ढेर इकट्ठा. इस ढेर के शीर्ष पर nitrocellulose लेटाओ.
5. पानी में कास्टिंग ट्रे संक्षिप्त पर जेल के लिए अतिरिक्त बफर चल दूर कुल्ला. फिर, ध्यान ट्रे बंद ढेर पर जेल स्लाइड शुरू करते हैं. जबकि ट्रे बंद जेल फिसलने, आवश्यक के रूप में टीबीएस के साथ झिल्ली पानी में गोता लगाना. अतिरिक्त बफर में मदद करता है जेल के तहत फंस बनने से बुलबुले को रोकने के है. एक हस्तांतरण विंदुक इस उद्देश्य के लिए अच्छी तरह से काम करता है.
6. बाद जेल ढेर करने के लिए ले जाया गया, बुलबुले के लिए अच्छी तरह से जांच. यदि कोई मौजूद हैं, जेल के किनारे उठा और पुन: लागू बफर जब तक बुलबुले बाहर काम किया जा सकता है.
7. जेल के शीर्ष पर शेष तीन पूर्व गीला GB002 टुकड़े रखो. ढेर के शीर्ष भर में दृढ़ता से एक विंदुक रोलिंग द्वारा सभी परतों के बीच संपर्क पूरी तरह से सुनिश्चित करें.
8. दो ऊंचा टीबीएस युक्त ट्रे के साथ स्थानांतरण ढेर पार्श्व. ऐसी है कि बाती के दोनों छोर टीबीएस में डूबे हुए है ढेर भर पूर्व गीला बाती कपड़ा.
9. एक अतिरिक्त प्लास्टिक ट्रे असर अतिरिक्त वजन (जैसे, पानी की 500 मिलीलीटर की बोतल) के साथ इकट्ठे हस्तांतरण ढेर कवर.
10. हस्तांतरण के लिए तीन घंटे, या रात भर की एक न्यूनतम के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें.
11. हस्तांतरण के बाद, झिल्ली मानक पश्चिमी सोख्ता द्वारा संसाधित किया जा सकता है.

Spheroplasting समाधान
1.2 डी sorbitol एम
0.5 मिमी ₂ MgCl
20 मिमी Tris, 7.5 पीएच
50 मिमी BME (ताजा जोड़ने)
0.5 मिलीग्राम / एमएल Zymolyase 100T (ताजा जोड़ने)

coration: रेखांकित, "lysis> बफर
100 मिमी 7.5 Tris
50 मिमी NaCl
10 मिमी BME (ताजा जोड़ने)
protease inhibitors के ताजा (जोड़ने)

4X नमूना बफर
2X TAE
20% ग्लिसरॉल
8% एसडीएस
वरीयता के लिए bromophenol नीले

पहले SDD उम्र Kryndushkin एट अल द्वारा की सूचना मिली थी ^1. एसडीएस प्रतिरोधी परिसरों का अध्ययन [साई +] खमीर में prion, और तब से बड़े पैमाने पर उपयोग में पाया दोनों prion और ^गैर prion 2-9 समुच्चय का अध्ययन. हालांकि, प्रोटीन के एक agarose जेल में एक झिल्ली निम्नलिखित वैद्युतकणसंचलन स्थानांतरित करने समस्याग्रस्त है, और एक विकृत ^दाग 5 छवि में परिणाम कर सकते हैं . इसके अतिरिक्त, जलमग्न electroblotting सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीक जेल के आकार के लिए व्यावहारिक सीमाओं परिचय और इस प्रकार कि संसाधित किया जा सकता नमूनों की संख्या. हम नीचे केशिका ¹⁰ स्थानांतरण, एक साधारण प्रक्रिया है जो शुष्क सोख्ता कागज के ढेर का उपयोग करता है के लिए जेल से nitrocellulose झिल्ली प्रोटीन हस्तांतरण के रोजगार से इन समस्याओं को संबोधित किया है. केशिका हस्तांतरण विरूपण रोकता है और बड़े जैल आसानी से संसाधित की अनुमति देता है. वहाँ कुछ बातें SDD उम्र का उपयोग कर से पहले विचार कर रहे हैं. कच्चे नमूने के लिए (जैसे, lysates), विशिष्ट प्रोटीन का immunodetection आवश्यक है. SDD उम्र पूरी तरह से ब्याज की प्रोटीन परिसरों denature नहीं करता है, तो प्रोटीन (ओं) को पता लगाया जा amyloidogenic क्षेत्र के बाहर एक मिलान टैग रखना चाहिए. Lysates आम तौर पर के रूप में वे एक सामान्य एसडीएस पृष्ठ के लिए होगा तैयार कर सकते हैं दो महत्वपूर्ण अंतर के साथ हो. सबसे पहले, वृद्धि हुई देखभाल proteolysis से गिरावट को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए. आंशिक रूप से denaturing यहां इस्तेमाल शर्तों proteases निष्क्रिय करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं, और भी लक्ष्य प्रोटीन अधिक proteolysis करने के लिए अतिसंवेदनशील बना सकते हैं. कम से कम दो गुना की सिफारिश की एकाग्रता में एक पूरा protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल का प्रयोग करें. दूसरा हीटिंग, नमूने बचा जाना चाहिए. यदि एक monomer सभी नकारात्मक नियंत्रण वांछित है, उदाहरण के लिए पुष्टि करने के लिए कि उच्च आणविक वजन प्रजातियों सहसंयोजक संशोधनों, 95 पर एक 10 मिनट ऊष्मायन ° सी में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो सबसे amyloids monomeric प्रोटीन को बहाल होगा करने के लिए कारण नहीं हैं.

हम इस प्रोटोकॉल के विकास के साथ सहायता के लिए साइमन Alberti धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के (GM25874), हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (एसएल के लिए) Investigatorship, और एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन predoctoral प्रशिक्षण अनुदान (आरएच करने के लिए) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

1. Kryndushkin, D.S., Alexandrov, I.M., Ter-Avanesyan, M.D. & Kushnirov, V.V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).

2. Alexandrov, I.M., Vishnevskaya, A.B., Ter-Avanesyan, M.D. & Kushnirov, V.V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).

3. Allen, K.D. et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics 169, 1227-1242 (2005).

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5. Bagriantsev, S.N., Kushnirov, V.V. & Liebman, S.W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology 412, 33-48 (2006).

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10. Nagy, B., Costello, R., and Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).

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Haitao Zhang

Department of Cell Biology and Molecular Genetics

Microbiology Bldg

University of Maryland

College Park, MD 20742

301 405 0547

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