Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Russian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

1, 2

1Center for Environmental and Genetic Medicine, Institute of Biosciences and Technology - Texas A&M Health Science Center, 2Center for Environmental and Genetic Medicine, Texas A&M University (TAMU)

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 184.73.7.143, User IP: 184.73.7.143, User IP Hex: 3091793807

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture). J. Vis. Exp. (20), e903, doi:10.3791/903 (2008).

Abstract: Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

Куриного эмбриона является ценным инструментом для изучения раннего эмбрионального развития. Его прозрачность, доступность и легкость манипуляций, делают его идеальным инструментом для изучения формирования и структурирования головного мозга, нервной трубки, сомитов и сердце зачатков. Применение куриных эмбрионов культуры включают электропорации ДНК или РНК конструкций для анализа функции гена, трансплантаты фактора роста покрыты бисером, таких как FGFs и БМП, а также целые горы на месте гибридизации и иммуногистохимии. Это видео демонстрирует различные этапы на куриных эмбрионов культуры; Во-первых, эмбрион эксплантированных в солевом растворе. Затем эмбрион сосредоточена на стеклянное кольцо. Мембраны, окружающие эмбрион поднимаются вдоль стенок кольца. Кольцо затем помещены в культуре блюдо с пулом альбуминовой. Культуры блюдо закрывают и помещают во влажную камеру, где эмбрион культивировали в течение до 24 часов. Наконец, эмбрион удаляется из кольца, фиксированная и обработаны для дальнейшего применения. Руководство по устранению неисправностей также представлен.

Protocol: Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

Часть 1: Скамья создана

  1. Влажной камере готовится путем размещения Kimwipe / DDH 2 O в пластиковой камере.
  2. Трубки Сокол собирать альбумина, посуда для культуры, кольца, препаратного стекла и удаление отходов размещаются на скамейке.
  3. Pyrex блюдо заполняется 1,4 л физиологического раствора (см. примечания []).

Часть 2: эмбрион эксплантированных в физиологическом растворе

  1. Яйца будут удалены из инкубатора после 16 часов (этап 4). Яйцо opene, нажав оболочки щипцами. Shell части удаляются.
  2. Тонкие альбумина собирается в трубке Falcon. Толстый альбумина удаляется пинцетом.
  3. Эмбрион помещается в пластиковый блюда внутри солевого блюдо. Остальные альбумина удаляется пинцетом.

Часть 3: Эмбрион сосредоточена на кольце

  1. Желточного мешка наклонена щипцами, чтобы эмбрион лица вверх.
  2. Желточного мешка разрезается на уровне или ниже экватора.
  3. Использование тонких щипцов, желточной оболочки стремительно очищенные. Желточной оболочки ориентирован так, что его гранулированных стороне (не детский хоккей) сталкивается вверх.
  4. Использование тонких щипцов, желточной оболочки находится на часовое стекло.
  5. Использование тонких щипцов, стеклянное кольцо наносится на верхней части желточной оболочки и зародыша по центру.
  6. Желточной оболочки поднимается вокруг краев стекла кольцо. Сборки удалено от солевых блюдо.

Часть 4: культура настроена под микроскопом

  1. Желточной оболочки поднимается над стеклянное кольцо с использованием тонких щипцов под микроскопом.
  2. Использование пипетки Пастера солевой снимается с внешнего края кольца.
  3. Использование тонких ножниц, избыток желточной оболочки удаляется из внутренней кромки стекла кольцо. Забота, чтобы не проколоть мембрану с пипеткой или щипцами.
  4. Эмбрион осторожно промыть физиологическим раствором, чтобы удалить свободные мембраны и желтком клеток.
  5. 200 мкл солевого добавляется к внешнему краю кольца (это будет способствовать последующей передачи).
  6. Сборка покрыты перевернутой блюдо пластика.

Часть 5: культура передается в инкубаторе

  1. Блюдо Сокол культура маркированы.
  2. 2,5 мл тонких альбумина добавляется в нижней части блюда Falcon.
  3. 200 мкл тонких альбумина добавляется к внутреннему краю крышки блюдо Falcon.
  4. Перевернутый блюдо будет удален из сборки.
  5. Использование тонких щипцов, стеклянные кольца скользили по краю часовым стеклом и переносят на блюдо Falcon.
  6. Все остальные солевые удаляется из внутренней поверхности кольца.
  7. Блюдо Сокол покрыта крышкой и опломбированы.
  8. Сборка помещается в влажной камере, а затем в инкубаторе.
  9. Эмбрионы культивировали в течение до 24 часов при 38 ° C.

Часть 6: После культуре, эмбрион является фиксированной, культура передается в инкубаторе

  1. Фиксация блюдо заполнено ледяным PBS (или DEPC-би-эс, если эмбрионы для переработки с целью на месте гибридизация).
  2. Культуры удаляется из инкубатора и сразу же помещают на лед. Культуры блюдо сразу же заполнено ледяным PBS / DEPC-би-эс.
  3. Эмбрион отделяется от желточной оболочки. Эмбрион переносится в фиксации блюдо, используя тупой конец пипетки Пастера.
  4. Эмбрион придавленный использованием тупыми концами тонкой щипцами. PBS покрытия фиксации блюдо будет удален. Fixative добавляется (см. примечания [б]).
  5. В зависимости от приложения, эмбрион является фиксированным в течение 6-8 ч при 4 ° С (криостата), O / N при температуре 4 ° С (в места нахождения имущества), или на 1 час при комнатной температуре в течение целого иммуногистохимии монтирования.
  6. Фиксатором удаляется и заменяется ледяным PBS / DEPC PBS.
  7. Для вниз по течению таких приложений, как на месте гибридизации или immantibody окрашивания: нервной системы и сердца, перфорированные использованием тупым концом иглы или микрокапиллярных микродиссекции нож, это будет препятствовать захвату зонд / антитела в последующих действиях.

    Примечания: [] Saline состоит из: раствор (на 1 л): 121,0 г хлористого натрия, 15,5 г хлорида калия, 10,4 г CaCl 2 · 2H 2 O, 12,7 г MgCl 2 6H 2 O; решение B (на 1 л) : 2,4 г Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,2 г NaH 2 PO 4 · 2H 2 O; Автоклав; Перед использованием смешайте 120 мл с 2700 мл H 2 O; Добавить 180 мл B. Mix [1]; [б] Fixative готовят непосредственно перед использованием (4% PFA в ФБР или DEPC-би-эс ибо в места нахождения имущества).

Часть 7: Представитель Результаты

До культуры, эмбрион на примитивной стадии полоски (HH4). В конце периода культуры, эмбрион развилась до HH10 (длина 2-3 мм) и отображается в центре культуры блюдо. Вполне возможно, для обозначения группы клеток с флуоресцентными карбоцианиновых DIIкак раз перед культурой (0ч) и следовать их передвижения по всей территории культуры периода. В этом случае клетки ниже узла Гензена (HN) были помечены DII. Эти клетки показали внести свой вклад в последовательное развитие сомитов (сом) и хорды (п).


Часть 8: Поиск и устранение неисправностей

Проблема Вызывать Средство
Эмбрион остается с желтком, а не сходит с мембраной (шаг 2) Бедные качество яйца Запрос свеже производства яиц, яйца Магазин при 13 ° C при получении. Инкубировать яйца тот же день, в день приезда.
Желточный мембраны слайд от стекла часовой следующее размещение кольцо (шаг 3) Альбумин остатки В шаге 2, чтобы убедиться, что все альбумина удаляется, потянув его от мембраны с наклоном щипцы
Эмбрион недоступно: лежит под мембраной (этап 4) Неправильно стороне мембраны вверх На шаге 3, убедитесь, что стороны мембраны содержащих желток гранул вверх. Блестящей, полированной стороной должна быть обращена вниз.
Эмбрион погружен в соленых / альбумина следующие культуры (шаг 6) Соленые / альбумина остается внутри кольца до культуры; отверстие в мембранной В шаге 5, убедитесь, что все альбумин / солевой удаляется из внутри кольца; На шаге 4, убедитесь, что вы не прокалывают мембрану с пинцетом (использование тупыми концами пинцета)
Эмбрион распался следующие культуры Бактериальная инфекция Стерилизуйте все инструменты и посуда; Использование антибиотиков / противогрибковым

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

Новый метод культуры 2 может быть использован для широкого спектра применений, начиная от прививок фактора роста содержащие бисером 3, для установки в целом гибридизация и целые горы иммуногистохимии 4. Культуры в течение 24 ч позволяет периода непрерывного контроля эмбрионального развития в таких приложениях как промежуток времени движения клетки анализа 5 или мониторинг GFP содержащие электропорации конструкций 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

Acknowledgements: Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

Эта работа была поддержана Маргарет М. Alkek Фонда РГНФ.

Materials: Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

Name Type Company Catalog Number Comments
Eggs Animal Charles River Laboratories Premium Fertile
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator Tool Lyon RX
Hybridization Incubator Tool Robbins Scientific, SciGene M1000
Pyrex dish (2) Tool
Watchmaker’s glass 50mm Tool VWR international 66112-060
Glass rings Tool Physical Plant facility cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.
Curved Forceps (1) Surgery Electron Microscopy Sciences 72991-4C
Forceps (2) Surgery Fine Science Tools 11002-13 blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil
Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas Surgery Electron Microscopy Sciences 62082-00
Fine scissors Surgery Fine Science Tools 14161-10
Plastic dishes Tool Falcon BD 353001
Rubber Bulb Tool Electron Microscopy Sciences 70980
Pasteur Capillary Pipette Tool Electron Microscopy Sciences 70950-12 round edge under flame
Microcapillary tube Surgery Sigma-Aldrich P1049-1PAK Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife Surgery Fine Science Tools 10056-12 Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam Surgery Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Reagent Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc) Reagent Acros Organics 10025025 Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave

References: Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

1. Pannett, P.A. & Compton, C.A. The cultivation of tissues in saline. Lancet 206, 381-384 (1924).

2. New D.T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).

3. Alvarez, I.S., Araujo, M & Nieto, M.A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).

4. Psychoyos, D. & Stern, C.D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122, 3263-3273 (1996).

5. Psychoyos, D. & Stern, C.D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development 122, 1523-1534 (1996).

6. Voiculescu O., Papanayotou C. & Stern, C.D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).

Ask the Author: Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

2 Comments

Hi,

Thanks for the wonderfull information.But I have a small query Is this called The Chick Chorio Allantois Membrane assay (CAM),if not will you please explain it if you have some idea of the same.

Thanks
S.S.Raza
MDC,Berlin
syedshadab.raza@mdc-berlin.de

1

Reply

Posted by: Syed R.March 22, 2009, 7:37 AM

Hi,

Thanks for the amazing video. But I have only a small and stupid question. I am actually working in New culture but I have few rings that I can use. Furthermore, the people who get it, lost the information of the person or company who get it for us. So my question is: would you please be kind enough to send me your contact for the rings for the New culture!?

Thanking you in advance

J. Furtado (PhD student)
CBME
Universidade do Algarve
Campus Gambelas
FERN, lab 3.29
8005-139, Faro
Portugal

2

Reply

Posted by: Joao FurtadoOctober 19, 2009, 11:46 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter