Methode voor Cultuur van Early kippenembryo's ex vivo (Nieuwe Cultuur)

Deel 1: Bench opgezet

1. Een vochtige kamer wordt bereid door het plaatsen van Kimwipe / DDH ₂ O in plastic kamer.
2. Een Falcon buis aan albumine, gerechten voor cultuur, ringen, horlogeglas en verwerking van afval te verzamelen worden geplaatst op bankje.
3. Pyrex schaal is gevuld met 1,4 l zoutoplossing (zie opmerkingen [a]).

Deel 2: Embryo is geëxplanteerde in zoutoplossing

1. Eieren worden verwijderd uit de broedmachine na 16 uur (fase 4). Het ei is opene door te tikken op de shell met een tang. Shell stukken zijn verwijderd.
2. De dunne albumine wordt verzameld in Falcon buis. De dikke albumine wordt verwijderd met een pincet.
3. Het embryo wordt geplaatst in een plastic schaaltje in de zoute schotel. De resterende albumine wordt verwijderd met een pincet.

Deel 3: Embryo is gericht op ring

1. De dooierzak is gekanteld met een pincet, zodat embryo naar boven wijst.
2. De dooierzak is geknipt op het niveau van de evenaar of lager.
3. Met behulp van fijne tang, is de vitelline membraan snel geschild. De vitelline membraan is zo georiënteerd dat de korrelige kant (niet glanzend) naar boven gezichten.
4. Met behulp van fijne tang, is de vitelline membraan op het horlogeglas.
5. Met behulp van fijne pincet, is een glazen ring aangebracht op de top van vitelline membraan en het embryo in het midden.
6. De vitelline membraan wordt opgeheven rond randen van de glazen ring. De montage wordt verwijderd uit de zoutoplossing schotel.

Deel 4: De cultuur is ingesteld onder de microscoop

1. De vitelline membraan wordt opgetild boven de glazen ring met fijn pincet onder de microscoop.
2. Met behulp van Pasteur pipet, is de zoutoplossing verwijderd van de buitenste rand van de ring.
3. Met behulp van fijne schaar, is teveel vitelline membraan verwijderd uit de binnenkant van het glas ring. Er wordt op gelet niet te doorboren het membraan met pipet of tang.
4. Het embryo wordt voorzichtig gespoeld met zoutoplossing om losse membranen en eigeel cellen te verwijderen.
5. 200 pi zoutoplossing wordt toegevoegd aan buitenkant van de ring (dit zal later te vergemakkelijken).
6. De montage is afgedekt met een omgekeerde plastic schaaltje.

Deel 5: De cultuur wordt overgedragen aan incubator

1. Een Falcon cultuur schotel is gelabeld.
2. 2,5 ml van dunne albumine wordt toegevoegd aan de bodem van de Falcon schotel.
3. 200μl van dunne albumine wordt toegevoegd aan de binnenrand van de deksel van de Falcon schotel.
4. De omgekeerde schotel wordt verwijderd uit de vergadering.
5. Met behulp van fijne tang, is de glazen ring geschoven langs de rand van het horlogeglas, en overgedragen aan de Falcon schotel.
6. Alle overige zoutoplossing wordt verwijderd uit inwendig oppervlak van de ring.
7. De Falcon schotel is bedekt met deksel en verzegeld.
8. De montage is geplaatst in vochtige kamer en daarna in de incubator.
9. De embryo's worden gekweekt tot 24 uur bij 38 ° C.

Deel 6: Na de cultuur, is het embryo vast, cultuur wordt overgedragen aan incubator

1. Een fixatie schotel is gevuld met ijskoude PBS (of DEPC-PBS als embryo's moeten worden verwerkt voor de in situ hybridisatie).
2. De cultuur is verwijderd uit de incubator en direct op ijs geplaatst. De cultuur gerecht wordt onmiddellijk gevuld met ijskoude PBS / DEPC-PBS.
3. Het embryo is losgemaakt van de vitelline membraan. Het embryo wordt overgebracht naar de fixatie gerecht, het gebruik van de stompe eind van een Pasteur pipet.
4. Het embryo wordt vastgepind met stompe fijne pincet. De PBS voor de fixatie gerecht wordt verwijderd. Fixeermiddel wordt toegevoegd (zie opmerkingen [b]).
5. Afhankelijk van de toepassing, wordt het embryo vast voor 6-8 uur bij 4 ° C (cryostaat), O / N bij 4 ° C (in situs), of 1 uur bij RT voor de ganse berg immunohistochemie.
6. Het fixatief is verwijderd en vervangen door ijskoud PBS / DEPC PBS.
7. Voor downstream toepassingen, zoals in situ hybridisatie of immantibody vlekken: het zenuwstelsel en het hart zijn geperforeerd met behulp van een stomp uiteinde microcapillaire naald of een microdissectie mes, dit zal voorkomen dat het vangen van probe / antilichaam in latere stappen.
   
   Opmerkingen: [a] Saline bestaat uit: oplossing A (voor 1 l): 121,0 g NaCl, 15,5 g KCl, 10,4 g CaCl ₂ .2 H ₂ O, 12,7 g MgCl ₂ 0.6 H ₂ O, oplossing B (voor 1 l) : 2,4 g Na ₂ HPO ₄ .2 H ₂ O, 0,2 g NaH ₂ PO ₄ .2 H ₂ O, Autoclaaf, voorafgaand aan het gebruik, mix 120 ml A met 2700 ml H ₂ O; Voeg 180 ml ​​B. Mix [1]; [b] Fixatief is vlak voor gebruik bereid met behulp (4% PFA in PBS of DEPC-PBS in situs).

Deel 7: representatieve resultaten

Voorafgaand aan de cultuur, het embryo wordt in primitieve streep stadium (HH4). Aan het einde van de cultuur periode is de embryo ontwikkeld om HH10 (lengte 2-3 mm) en is zichtbaar in het centrum van de cultuur schotel. Het is mogelijk om een ​​groep cellen label met carbocyanine fluorescerende DIInet voor cultuur (0h) en volg hun beweging in de cultuur periode. In dit geval werden de cellen onder knooppunt Hensen's (HN) gelabeld met DII. Deze cellen worden getoond bij te dragen aan de geleidelijke ontwikkeling van somieten (SOM) en notochord (n).

Deel 8: het oplossen van problemen

De nieuwe cultuur van methode ² kan gebruikt worden voor een breed scala aan toepassingen, variërend van enten van de groei factor met kralen ^3, op hele berg in situ hybridisatie en hele berg immunohistochemie ^4. Cultuur over een periode van 24 uur maakt de continue monitoring van de embryonale ontwikkeling in toepassingen zoals time lapse cel bewegingsanalyse ⁵ of de monitoring van GFP met geëlektroporeerd constructen ^6.