Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

Parte 1: Banco establecido

1. Una cámara húmeda se prepara colocando Kimwipe / _ddH2O en la cámara de plástico.
2. Un tubo Falcon a recoger los platos de albúmina, la cultura, anillos, vidrio de reloj y la eliminación de desechos se colocan en el banco.
3. Plato Pyrex se llena con solución salina 1,4 l (ver notas [a]).

Parte 2: Embrión es explantados en solución salina

1. Los huevos son retirados de la incubadora después de 16 horas (fase 4). El huevo es opene tocando la concha con una pinza. Pedazos de la cáscara son removidas.
2. La delgada albúmina se recoge en un tubo Falcon. El grueso de albúmina se retira con una pinza.
3. El embrión se coloca en un plato de plástico en el interior del plato de solución salina. La albúmina restante se elimina con las pinzas.

Parte 3: Embrión se centra en el anillo

1. El saco vitelino se inclina con una pinza para que el embrión hacia arriba.
2. El saco vitelino se corta a nivel del ecuador o por debajo.
3. Con unas pinzas finas, la membrana vitelina es rápidamente pelados. La membrana vitelina está orientada de modo que su lado granular (no brillante) hacia arriba.
4. Con unas pinzas finas, la membrana vitelina se coloca en el vidrio de reloj.
5. Con unas pinzas finas, un anillo de cristal se aplica en la parte superior de la membrana vitelina y el embrión está centrado.
6. La membrana vitelina se eleva alrededor de los bordes del anillo de cristal. El montaje se retira de la fuente de solución salina.

Parte 4: La cultura se configura bajo el microscopio

1. La membrana vitelina se levanta sobre el anillo de cristal con unas pinzas finas bajo el microscopio.
2. Utilizando una pipeta Pasteur, la solución salina se elimina desde el borde exterior del anillo.
3. Usando tijeras finas, el exceso de membrana vitelina se elimina desde el borde interior del anillo de cristal. Hay que tener cuidado de no perforar la membrana con una pipeta o fórceps.
4. El embrión es suavemente enjuagarse con solución salina para eliminar las membranas de las células sueltas y yema de huevo.
5. 200 l de solución salina se añade al borde exterior del anillo (lo que facilitará su posterior transferencia).
6. El conjunto se cubre con un plato de plástico invertida.

Parte 5: La cultura se transmite a la incubadora

1. Un plato de cultivo de Falcon se etiqueta.
2. 2,5 ml de albúmina fina se añade a la parte inferior de la placa Falcon.
3. 200μl de fina albúmina se agrega a la parte interior de la tapa de la placa Falcon.
4. El plato invertido se retira de la asamblea.
5. Con unas pinzas finas, el anillo de cristal es deslizado a lo largo del borde del vidrio de reloj, y se transfiere a la placa Falcon.
6. Todas las salinas restante se elimina de la superficie interior del anillo.
7. El plato Falcon está cubierto con una tapa y sellado.
8. El conjunto se coloca en la cámara húmeda y luego en la incubadora.
9. Los embriones se cultivaron durante 24 horas a 38 ° C.

Parte 6: A raíz de la cultura, el embrión se fija, la cultura se transfiere a la incubadora

1. Un plato de fijación está lleno de helado de PBS (PBS-DEPC o si los embriones se van a procesar para la hibridación in situ).
2. La cultura se retira de la incubadora y de inmediato se coloca en hielo. La placa de cultivo se llena inmediatamente con helado de PBS / PBS-DEPC.
3. El embrión se separa de la membrana vitelina. El embrión se transfiere a la placa de fijación, con el extremo romo de una pipeta Pasteur.
4. El embrión se fija por el uso de extremos romos pinzas finas. La PBS que cubre el plato de fijación se retira. Fijador, se añade (ver notas [b]).
5. Dependiendo de la aplicación, el embrión se fija por 6-8 horas a 4 ° C (criostato), S / N a 4 ° C (en situs), o 1 hora a temperatura ambiente durante toda la inmunohistoquímica de montaje.
6. El fijador es eliminado y reemplazado con helado de PBS / PBS DEPC.
7. Para aplicaciones posteriores, tales como la hibridación in situ o tinción immantibody: el sistema nervioso y el corazón están perforadas con una aguja punta roma microcapilar o un cuchillo de microdisección, lo que evitará la captura de la sonda / anticuerpo en los pasos posteriores.
   
   Notas: [a] de solución salina se compone de: solución A (de 1 l): 121,0 g de NaCl, KCl 15,5 g, 10,4 g de CaCl ₂ .2 H ₂ O, 12,7 g de MgCl ₂ .6 H ₂ O, la solución B (para 1 l) : 2,4 g de Na ₂ HPO ₄ .2 H ₂ O, 0,2 g de NaH ₂ PO ₄ .2 H ₂ O; autoclave; Antes de su uso, mezclar 120 ml A con 2700 ml de H ₂ O, agregar 180 ml ​​B. Mix [1]; [b] fijador se prepara justo antes de su uso (4% PFA en PBS o PBS-DEPC en situs).

Parte 7: Resultados de Representante

Antes de la cultura, el embrión se encuentra en fase de línea primitiva (HH4). Al final del período de cultivo, el embrión se ha desarrollado hasta HH10 (longitud de 2-3 mm) y es visible en el centro de la placa de cultivo. Es posible que la etiqueta de un grupo de células con carbocyanine fluorescentes DIIjusto antes de la cultura (0 h) y seguir sus movimientos en todo el período de cultivo. En este caso, las células por debajo del nodo de Hensen (HN) fueron etiquetados con DII. Estas células son factores que contribuyen a desarrollar de forma progresiva somitas (SOM) y la notocorda (n).

Parte 8: Solución de problemas

El método de cultivo de Nueva ² puede ser utilizado para una amplia variedad de aplicaciones, que van desde los injertos de factor de crecimiento que contiene perlas de ^tres, para montar toda la hibridación in situ y todo monte inmunohistoquímica ^4. La cultura durante un período de 24 horas permite el seguimiento continuo del desarrollo embrionario en aplicaciones tales como el análisis de lapso de tiempo el movimiento celular ⁵ o el seguimiento de las buenas prácticas agrarias que contienen construcciones electroporated ^6.