双整装原位杂交技术在早期鸡胚

第1部分：固定的胚胎

1. 填充与冰冷的DEPC - PBS清扫菜。置于冰上。打开用镊子轻敲壳蛋和删除壳件。
2. 用镊子取出厚厚的白蛋白。卵黄囊倾斜粗钳，使胚胎朝上。
3. 用剪刀，切割围绕胚胎的卵黄囊平方米。
4. 使用勺子，取出胚胎从卵黄和冰冷的DEPC - PBS。
5. 在显微镜下，删除膜和蛋黄，并转移到固定菜。
6. 牵制，除去DEPC - PBS。 DEPC - PBS在4％煤灰更换和修复O / N在4 ° C。
7. 删除固定液。更换与冰冷的DEPC - PBS。使用钝年底microcapillary针或显微切割刀，穿孔的神经系统和心腔，防止探头诱捕。
8. 2X 10分钟DEPC - PBS洗0.1％Tween - 20的（PBT）的。脱水10分钟每25％，50％，75％甲醇在PBT。两次在100％甲醇脱水胚胎。在甲醇储存在-20 ° C。

第2部分：预杂交

1. 补充水分胚胎75％，50％和25％甲醇在PBT中的每个10分钟。在PBT洗净2X 10分钟。
2. 同时，准备冰冷的固定液（4％多聚甲醛在PBT）。替换蛋白酶K溶液（3毫升/瓶; [5克/毫升]最后在PBT）PBT。确保整个小瓶暴露蛋白酶K溶液轻轻滚动小瓶;故障排除的曝光时间。
3. 使用核糖核酸免费巴斯德吸管删除蛋白酶K，添加固色剂（2毫升）。整整20分钟，立即放在冰上。
4. 所有RT洗上nutator执行。洗2X 10分钟，在PBT和1x在PBT 10MN含有50％的杂交缓冲液。
5. 在杂交缓冲液清洗1X。孵育65 °彗星在4-5小时的杂交缓冲液2毫升。

第3部分：与探针的杂交胚胎

1. 挖掘和FITC耦合探针合成是在附录中描述。预计将提供一个强有力的信号探头，应synhesized FITC含核苷酸;较弱的探头应与辛含核苷酸合成。
2. Prewarm探针在杂交缓冲液（500毫微克/毫升），使用2 ml小瓶。及时更换探头解决方案的杂交缓冲液。不要让胚胎干。孵育16小时，在65 ° C。
3. 替换探针杂交缓冲液，2洗，30分钟在65 ° C。在杂交缓冲液/ MABT中清洗15分钟（1 / 1 V / V /）在65 ° C。

第4部分：辛抗体孵育和显色反应

1. 洗净MABT 2X20万。在2％BBR / MABT清洗1小时。洗5小时，在2％BBR/20％HISS / MABT（封闭液）。孵育封闭液稀释1:2000辛抗体，O / N在4 °上nutator彗星。
2. 洗3X 10分钟在MABT，3X MABT每1小时。
3. 洗净NTMT 2X 20分钟。加入200ul NBT / BCIP底物10毫升NTMT。立即从小瓶NTMT和更换1-2毫升NBT / BCIP显缓冲区。在黑暗的地方。 20分钟后，显示器的色彩反应，并在此后每隔20分钟。
4. 显色反应（应该出现蓝色），在PBS洗10分钟，针用PBS填充的固定菜，并取代与4％的PBS PFA解决方案。修正/ O在4 ° C。
5. 转移到新的闪烁瓶中。 PBST洗涤（PBS 1％吐温20）2X10万。在MABT 2X 10分钟洗净。
6. 在63 ° C，在MABT 30分钟的孵育

第5部分：FITC标记抗体孵育和显色反应

1. 洗2倍的MABT 10分钟，1小时2％，5小时的封闭液BBR / MABT
2. 孵育在碱性磷酸酶偶联抗FITC抗体（1:500）的O / 4个N ° C。
3. 洗3X 10分钟在MABT，3X MABT每1小时。
4. 在TBS的pH值8.45与0.1％Tween - 20的（TBST）2X 20分钟洗净。
5. 准备在TBST使用试剂盒提供的试剂1,2和3的矢量红溶液（5毫升）。立即从小瓶TBST和替换矢量红缓冲区。在黑暗的地方。监控显色反应后40分钟，30分钟，其后每隔。
6. 下列颜色反应（应该会出现红色），将胚胎转移，以PBS。

第6部分：固定和加工

1. 转移到含PBS的固定菜，和4％PFA固定在室温或O / N为20分钟，在4 ° C。
2. 在PBS，2个10分钟洗净。摄影过程中，转移至20％甘油的PBS（这将使半透明的胚胎）。要创建一个会议厅，切2条PVC胶带，幻灯片上叠加。切方在使用刀片中心。去掉方使用产钳。
3. 蜡切片的过程中，转让，以PBS冲洗2X 10分钟，脱水甲醇梯度（25％，50％，75％和100％的PBS，每10分钟）。
4. 丙醇，3MN更换。 1,2,3,4 - 四氢更换，20分钟之后Histoclear（2个1小时）。更换histoclear /蜡1 / 1（V / V）60 ° C时为1小时。替换一个过程蜡为组织学。

第7部分：解决方案

杂交缓冲液中，保存在-20 ° C的猎鹰，50毫升25毫升甲酰胺; 3.25毫升（20xSSC）; 0.5毫升（0.5M EDTA）; 1毫升（10％Tween - 20的）; 2.5毫升（1％SDS） 125 UL（20mg/ml tRNA的）; MABT 100ul（50毫克/毫升的肝素），准备100MM马来酸，pH值至7.5氢氧化钠颗粒。 150MM氯化钠和0.1％Tween - 20的。

NTMT（在使用前），50毫升：1毫升（5M氯化钠）; 2.5毫升（2M的Tris - HCl pH9.5）; 1.25毫升（2M氯化镁_2）; 5毫升（10％Tween - 20的）。

TBST：0.1M的Tris - HCl，pH值8.45，0.15米，氯化钠0.1％Tween - 20的。

第8部分：故障排除

第9部分：代表结果

代表胚胎如下：（一）胚胎（阶段HH7），是标示与DIG - SOX探头（蓝色）和一个FITC -δ- 1的探头（红色）。 （二）胚胎（阶段HH8）都标有一挖，PAX6探头（蓝色）和FITC - SHH探头（红色）。 NF，神经倍，ANP，前神经板，PSM，presomitic中胚层，N，NT，脊索，神经管）。从博士实验室的探头礼物。 C.塔宾，古尔丁，D.恩里克，和J.布里斯科。

2色整装原位杂交方法是用来确定空间和时间的基因表达模式，使用一个或两个基因的兴趣。应用领域包括新基因的基因表达模式的^评估 （如1,2，以及以下侮辱基因^表达的变化（3 ^胚胎操作 ，珠4，RNA ^或DNA电构造5）。