Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

1, 2, 2

1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University School of Medicine

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 50.19.155.235, User IP: 50.19.155.235, User IP Hex: 840145899

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

L Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936, doi:10.3791/936 (2008).

Abstract: التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

منذ تطويره من قبل Sakmann وNeher 1 ، 2 ، أصبح المشبك التصحيح على النحو المنصوص عليه تقنية مفيدة للغاية لقياس كهربية من القنوات الأيونية واحدة أو متعددة في الخلايا. ويمكن تطبيق هذه التقنية على القنوات الأيونية في بيئتها الأصلية على حد سواء ، وأعرب عن غيري في الخلايا ، مثل البويضات التي تحصد من الضفادع الأفريقية المخالب ، القيطم المورق. هنا ، نحن تصف تقنية راسخة من تسجيل المشبك التصحيح من البويضات القيطم. وتستخدم هذه التقنية لقياس خصائص القنوات الأيونية إما يتم التعبير عنها في السكان (macropatch) أو بشكل فردي (على قناة واحدة تسجيل). علينا أن نركز على تقنيات لتعظيم نوعية البويضة وإعداد جيل الختم. مع كل العوامل الأمثل ، وهذا الأسلوب يعطي احتمال توليد ختم ناجحة أكثر من 90 في المئة. قد يكون الأمثل في عملية مختلفة من قبل كل باحث على أساس عوامل يرى انه أو انها الأكثر أهمية ، ونحن نقدم النهج الذي قد يؤدي الى نجاح أكبر في أيدينا.

Protocol: التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

الجزء 1 : إزالة الغشاء المحي

  1. إعداد مجموعتين من الملقط. نحن نفضل رقم 5 الملقط ، حيث تم ضبط واحد شحذ قليلا مع ملف. أيضا بإعداد ماصة نقل وقص الزجاج والنار تلميع - 7 "باستور ماصة.
  2. وأوصت : لمنع الانزلاق من البويضات ، وقطع دائرة الشبكة (المربعات 1 ملم) والغراء في قاع طبق بيتري 60mm. ويمكن إعادة استخدام هذا الطبق إلى أجل غير مسمى إذا ما واصلت النظيفة بين الاستخدامات.
  3. ملء طبق بيتري في منتصف الطريق مع حل مفرط التناضح (انظر الوصفة) ووضع تحت المجهر تشريح.
  4. 1-3 إزالة البويضات القيطم من حل الحضانة مع ماصة باستير مصقول ومكان في الطبق.
  5. انتظر 15S -- 2 دقيقة للخلايا أن يبدأ في الانكماش. أوقات أطول جعل خلايا قشر أسهل ؛ أقصر المهل الزمنية لصحة الخلايا من أجل التصحيح.
  6. كما تقلص الخلايا ، والغشاء المحي تبدأ لتصبح بالكاد مرئية باعتبارها طبقة شفافة فوق الخلية. حدد خلية سليمة (بدون جدلات أو عيوب) لتقشير.
  7. مع زوج واحد من الملقط ، فهم بلطف الغشاء المحي دون الإضرار غشاء البلازما. مع الآخر ، فهم بالقرب من نفس المكان وبلطف المسيل للدموع واضحة بصرف النظر الغشاء وخالية من الخلية.
  8. مع ماصة باستور ، نقل بعناية الخلية إلى غرفة تسجيل. لاحظ أن الخلية سيكون هشا بعد إزالة المحي.

الجزء 2 : الجيل Gigaseal

  1. ملء ماصة تسجيل مع المالحة. استخدام الحد الأدنى من حجم الحل الذي يجعل الاتصال الكهربائية جيدة مع السلك الكهربائي من أجل تقليل السعة ماصة.
  2. نفض الغبار مرات عدة ماصة للسماح بتعويم فقاعات والانزلاق على السلك الكهربائي.
    الضغط على ماصة شغلها. ويمكن القيام بذلك عن طريق الفم أو مع مضخة ماء من متجر للحيوانات الاليفة. هذا الضغط ضروري للحفاظ على ماصة لأنه ينظف الصلبان واجهة السائل وينتقل إلى الخلية.
  3. العثور على البويضة في الغرفة ، والتركيز بشدة على حافة الخلية.
  4. مع ماصة للخروج من الحمام ، ومركز الطرف (من التركيز) أعلاه الخلية. يقلل هذا الوقت الذي يقضيه في الحمام قبل جيل الختم.
  5. إسقاط ماصة أسفل إلى التركيز الشديد المقبل إلى الخلية. جعله مقربة (~ 50 ميكرون). سترى التشويه صغير من الحل للخروج من دفع ماصة من الضغط الخلفي.
  6. باستخدام برنامج التصحيح المشبك ، والتحقق من مقاومة ماصة (هدفنا هو حوالي 3-4 MΩ) وصفر الحالي باستخدام الجهد الإزاحة.
  7. مع الضغط الايجابي على ماصة ، نقل معلومات سرية ببطء نحو الخلية في حين رصد المقاومة بصريا أو باستخدام جهاز عرض الصوت الذي يولد لهجة الذي يتناسب مع وتيرة المقاومة. كما غيض يبدأ لمسة الخلية ، فإن المقاومة الزيادة.
  8. ولكن فجأة التبديل بلطف من الموجب إلى الضغط السلبي من قيمة مطلقة تقريبا نفس. وينبغي زيادة المقاومة لتشكيل الختم.
  9. معظم الوقت ، وتشكيل ختم يحدث في غضون عدة ثوان ؛ مطلوبة أحيانا 30-60 ثانية.
  10. بمجرد أن المقاومة في 1GΩ ، يمكن الضغط من أجل الإفراج محايدة. لديك الآن إلى التصحيح على الخلية. للحصول على التصحيح من الداخل إلى الخارج ، وسحب بعيدا عن الخلية بسرعة. للخارج التدريجي ، انظر أدناه.

الجزء 5 : خارج التدريجي طوبولوجيا (اختياري)

  1. مباشرة بعد تحقيق gigaseal ، وتمزق الغشاء. ويمكن القيام بذلك مع شفط حادة ، لكننا نفضل الخامس (أ) 1 1 مللي ثانية للنبض. وينبغي أن المقاومة تنخفض إلى أكثر قليلا من المقاومة ماصة الأولي.
  2. نقل ماصة بعيدا عن الخلية ببطء وسلاسة. يجب أن تشاهد سحب قسم من الخلية مع ماصة. فجأة ، وخلال بضع ثوان ، وسوف الخلية المفاجئة الظهر والمقاومة يجب على الفور وبشكل متزامن عودة إلى GΩs.
  3. لديك الآن تصحيحا في تكوين خارج التدريجي. ما يتعرض له من أي ectodomains القنوات الأيونية وشملت إلى الحمام.

الجزء 6 : النتائج المتوقعة

عموما ، والأختام أعلى المقاومة هي الأفضل ، وعاش فترة أطول. 10 GΩ هو المبدأ جيدة لنوعية عالية الأختام. في تجربتنا ، فإن فرص الحصول على أختام هذه النوعية تختلف مع العديد من العوامل ، لا سيما الخلايا الماصة والجودة. يمكن أن يكون التصحيح على أسعار اقتناء أكثر من 95 ٪ مع الخلايا السليمة ، الماصات نظيفة ، وباحث من ذوي الخبرة. قد تكون هذه البقع تستمر لعدة دقائق ومناسبة لأية دراسة الكهربية من القنوات الأيونية التي أعرب عنها في البويضات القيطم ، بما في ذلك تسجيلات قناة واحدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

هناك العديد من المعلمات تسجيل الكهربية لم تناقش هنا. تلاعب في الإعداد ، ونظام إدارة الضوضاء ، والتعبير القناة ، والبروتوكولات تسجيل كلها أمور حاسمة أيضا إلى نتائج تجريبية جيدة.

في تجربتنا ، هذه هي أهم معالم لتشكيل الأختام يعتمد عليها : البويضات ذات جودة عالية ، وإزالة الغشاء المحي بسرعة (ويعرف أيضا باسم "تقشير") ، استخدام ماصات سحبت حديثا حمايتها من الغبار ، وماصات سلس ، تطبيق الضغط الايجابي عند دخول الحمام الحل ، وأوقات وجيزة في الحمام قبل الختم. وقال هذا الوجود ، تجربة تختلف على نطاق واسع وآخرون مجموعات خاصة بهم من أهم العوامل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Acknowledgements: التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

تقلص وصفة الحل هو من مختبر الدريتش RW. نشكر وكالات التمويل والمؤسسات التالية للحصول على الدعم : المعاهد القومية للصحة ، المؤسسة الوطنية للعلوم ، الجمعية الأمريكية للقلب ، الضمور العضلي جمعية ، ودونالد وباء ديليا E. مؤسسة باكستر ، وصندوق الوقف وKlingenstein ماكنايت علم الأعصاب.

Materials: التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Name Type Company Catalog Number Comments
Patch Clamp Amplifier & Software Instrument HEKA Instruments EPC-10 Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B)
No. 5 forceps (two pairs) Tool Fine Science Tools
Oocyte shrinking solution Reagent Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine
woven mesh 800 um Spectrum Labs 146481

References: التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

  1. Neher, E. & Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature 260, 799-802 (1976)
  2. Sackmann, B. & Neher, E. Single-channel Recording. Plenum Press, New York (1983).

Ask the Author: التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

13 Comments

Thanks. Good presentation.

1

Reply

Posted by: Hezi DJanuary 12, 2009, 9:34 AM

How could you get attached without oocyte movement?

2

Reply

Posted by: AnonymousOctober 9, 2009, 2:07 AM

After the vitelline membrane has been removed, a healthy oocyte will loosely adhere to the bottom of the recording chamber. Unhealthy or small oocytes are often too buoyant to adhere to the chamber. I would recommend selecting larger, more mature oocytes for recording.

2.1

Reply

Posted by: Brandon JohnsonOctober 9, 2009, 10:54 AM

how patch clam techneque is performed?

3

Reply

Posted by: shyamsunderOctober 30, 2009, 3:32 AM

If possible, I would like to know which kind of glass you are using for the inside out macropatch of Oocytes.
Let me at your convenience.
Unfortunately I could not look at the presentation




4

Reply

Posted by: Lijuan M.February 23, 2010, 8:59 AM

I would like to know what does your pipete solution contains?

5

Reply

Posted by: AnonymousMay 10, 2010, 12:49 PM

my pipete solution contains 2mM KCl, 91 mM NaMeSO3, 1 mM MgCl2, 5mM NaOH and 5mM HEPES.

5.1

Reply

Posted by: LijuanMay 11, 2010, 3:17 AM

Did you try different oocyte shrinking solutions or just took occasionally the first one from the literature?
Thank you.
I did not watch the movie. :)

6

Reply

Posted by: VadimApril 6, 2011, 1:37 PM

Vadim,
Here is the recipe for the shrinking solution: (in mM) NMDG-aspartate (220), MgCl2 (1), EGTA (10), KCl (2), HEPES (10), and amiloride (0.3), adjusted to pH 7.4 with NMDG.

6.1

Reply

Posted by: Miriam G.April 6, 2011, 3:35 PM

thank you for your comment. I did not try different shrinking solutions and sometimes I did not using the shrinking solution at all to peel the vitelline membrane. I will try the shrinking solution you referred to me and let me know when I succeed to get the patch.

7

Reply

Posted by: LijuanApril 7, 2011, 3:28 AM

Dear mbg,

thank you. I'm wondering why you add amiloride? Do you know what it is? :) My question is because there are several compositions of shrinking solutions in literature. You success rate with sealing is very high, 90%, it may depend on the group of oocytes (frog), shrinking solution, other factors. So, it's not so strict. Also Axon does sell Axopatch, not EPC-10. You can also use the other twissors, not No. 5 forceps from Fine Science Tools.
Thank, but in general the idea is good. :)
Actually, what is important for shrinking solution and how is will effect the sealing %? pH, low Ca, just osmotic composition? It's a question not for you, you have good results. Some people have a publication in using enzyme to remove vitelline membrane.
You can read here: http://yanala.wikispaces.com/Xenopus+Laevis+Oocytes http://mdc.custhelp.com/euf/assets/content/AxoBits12.pdf (p. 6) http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WBK-4DGD8RT-3&_user=983321&_coverDate=11%2F19%2F2004&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gateway&_origin=gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1709419840&_rerunOrigin=google&_acct=C000044920&_version=1&_urlVersion=0&_userid=983321&md5=d2723b89477973ada3dd53dc11638c1f&searchtype=a
Best wishes.

8

Reply

Posted by: VadimApril 7, 2011, 8:48 AM

We include amiloride in our solutions because we study amiloride-sensitive currents. This drug is not needed for other ion channels.

8.1

Reply

Posted by: Miriam G.July 20, 2011, 2:44 PM

Yes, sure, thank you. I worked with ENaC, so the question was rather to see that you understand what you are doing. I recorded single channels today also, but with the different shrinking solution. There might be more flexibility and not so exact recipes. Good luck.

10

Reply

Posted by: VadimJuly 20, 2011, 5:42 PM

hi, what type of glass pippettes are you using?

11

Reply

Posted by: IsabellaNovember 8, 2011, 2:51 AM

We use borosilicate glass to make our pipettes. See our other videos on pulling pipettes and pressure polishing for tips on pipette fabrication

12

Reply

Posted by: Miriam G.November 8, 2011, 3:10 AM

Hi, How do you know what type of channel you have at the tip? There are several hundreds to thousands of channels on a cell membrane.

13

Reply

Posted by: SrinivasanMarch 15, 2012, 7:48 PM

The technique is about over- expressing your channel of interest in the Xenopus oocytes membrane, by inyecting the RNA into the cell, so It's not a problem to identify that is your channel what you are recording. Also you can avoid having other kinds of channels by co-inyecting the antisense of that specific sequence or just blocking it in some other way (for example working at calcium free conditions in your recording solution, to avoid activation of Cl- channels activated by calcium). Also, this kind of recording is done at the whole cell level so you know you're measuring several channels, not just one. If you want just one the single channel technique can be applied (after taking out the vitelline membrane of the oocyte).

14

Reply

Posted by: CAAMarch 15, 2012, 8:06 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter