CyDye DIGE 플루어 최소 염료를 사용하여 셀 표면 단백질의 선택적 Labelling

세포 배양

1. GlutaMAX 나는 10 % 태아 송아지 혈청, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML의 스트렙토 마이신 황산 (Invitrogen)를 포함과 함께 F - 12 햄 매체의 표준 세포 배양 절차를 사용하여 중국어 햄스터 난소 세포를 (CHO - K1) 성장.
2. 혈청이없는 미디어로 문화 매체를 교환. 라벨 세포 표면 단백질은 CyDye DIGE 플루어 Cy3 또는 Cy5 최소한의 염료 (아래 섹션 세포 표면 라벨을 참조) 다른 시간 지점에 있었다.
3. 각각의 시점과 CyDye DIGE 플루어 Cy2와 레이블에서 세포의 풀 같은 숫자. 각각의 2 - D 겔을위한 내부 표준으로 이들을 사용합니다.
4. 실험의 대부분은 CHO - K1 세포로 수행할 수 있지만, 마우스 배아 섬유아 세포 (3T3 L1)와 마우스 복수의 림프종 lymphoblasts (EL4)도 (데이터가 표시되지 않음) 사용할 수 있습니다.
5. GlutaMAX II와 DMEM 매체 두 후자의 셀 유형을 성장하지만, 그렇지 않으면, CHO - K1 세포에 사용되는 동일한 조건을 사용합니다.

세포 표면 라벨링

1. 조심스럽게 계산 및 50-10 x106 세포의 aliquots 나누어 아닌 효소 자기편 세포를 분리. 정지 성장 세포 들어, 분리 단계를 생략하십시오.
2. 5 분 약 800 XG에있는 세포를 원심 분리기 suspensions. 매체를 포함하는 supernatants를 제거합니다.
3. 1 ML 얼음 차가운 행크의 밸런스드 소금 솔루션 (HBSS) 산도 8.5에서 resuspendion하여 알약을 씻으십시오. 4 800 XG ° 2 분 C에서 Centrifuged.
4. 뜨는를 제거하고 200 μl 얼음 차가운 라벨 버퍼에있는 세포 펠렛을 (HBSS 산도 8.5, 1 M 우레아) resuspend.
5. 어두운 얼음 속에서 20 분 동안 600 pmol CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료로 그대로 세포 라벨.
6. 라이신 20 μl 10 MM을 추가하여 반응을 끄다. 10 분 알을 품다.
7. 4 800 XG에서 원심 분리 ° C 2 분 뒤에 500 μl HBSS의 산도 7.4에 resuspension에 의해 두 번 표면 라벨 세포를 씻으십시오.

세포 용해 및 분류

1. 150 μl 차가운 용해 완충액 (7 M의 요소, 2 M 티오 우레아, 4 % 챕스, 30 MM 트리스, 5 MM의 마그네슘 아세테이트 산도 8.5)에 표면 라벨 세포를 Lyse. 가끔 vortexing 최소한 1 H 위해 얼음에 둡니다.
2. 4 10 000 XG에 lysates을 원심 ° C를 5 분. 새로운 튜브에 뜨는를 전송합니다. 이 예제는 모든 세포 단백질을 포함하는 비 fractionated 예제입니다.
3. 병렬, 멤브레인 및 cytosolic 분수 이전 2 - D 겔 전기 영동에로 (막 분획화 키트를 사용하여 피어스), 위에서 다음 분류 셀 알약을 씻으십시오. 멤브레인 분율은 내부와 세포 표면 막 단백질을 포함하고 있습니다.
4. 비교, 표준 Ettan DIGE 절차 ^3에 따라, 그리고 lyse, 레이블, 그리고 세포 마지막으로, 분류. D 퀀트 키트 (GE 헬스케어) - 2를 사용하여 샘​​플의 단백질 농도를 결정합니다.

2 - D 전기 영동

1. Immobiline의 DryStrip의 젤, Immobiline DryStrip Reswelling 트레이, 하루 450 μl DeStreak의 Rehydration 솔루션 24cm (0.5 %는 IPG 버퍼)를 사용하여 pH를 3 11NL을 (24cm) Rehydrate.
2. 매니폴드의 양극 컵로드하여 DryStrip 젤류을 Immobiline하고 지시에 따라 Ettan IPGphor II IEF 시스템을 사용하여 isoelectric 초점 (IEF)을 수행할 수있는 CyDye - 라벨 샘플 (50 μg 총 단백질에 해당)이 적용됩니다.
3. IEF 후, 대형 (26 X 20cm) 12.5 %의 polyacrylamide의 젤 (SDS - PAGE) 위에 두 단계와 장소에 부착된를 평형. 0.5 % 아가로 오스와 중첩 (bromophenol 파란색을 포함하는 버퍼를 실행에). 30 분 5 W / 겔에서 Ettan DALTtwelve 대형 수직 시스템을 사용하여 2 - D 전기 영동을 실행한 다음 15 염료 앞까지 W / 젤은 젤 하단에 도달합니다.

이미징 및 데이터 분석

1. 2 - D 전기 영동을 마친 후, 태풍 9,410 변수 모드 영상기를 사용하여 Cy2, Cy3 또는 Cy5에 대한 젤을 검사합니다.
2. DeCyder 2 - D 차동 분석 소프트웨어 ^사를 사용하여 막 분수, cytosolic 분수, 비 fractionated 샘플에서 현장지도를 비교합니다.

포스트 - 염색법

1. 이미징 후, 실버 표준 절차에 따라 ⁵ 젤을 얼룩.

단백질 식별

1. , 수확을 성장뿐만 아닌 fractionated 샘플 위에서 설명한 예비 금액 (10 x106 CHO 세포에서 약 1 MG 총 단백질) 세포를 씻어 및 lyse. 대못으로 Cy5 세포 표면 라벨 샘플을 (위 참조)를 사용하고, 단백질의 unlabelled 예비 금액과 함께 적용됩니다.
2. 위에서 설명한 2 - D 전기 영동을 수행하지만, 이번에는, aplly 600 μg 레이블이 지정되지 않은 세포는 양극 컵 응용 프로그램에 의해 스파이크 표시 50 μg 세포 표면과 함께 lysate. 올바른 장소 따기 수 있도록 참조 마커를 사용하여 할 곳추천 ^3에 따라 겔 주조하기 전에 트윈은 유리 접시.
3. 딥 퍼플 총 단백질 ³ 얼룩 사용하는 총 단백질 얼룩 다음 Cy5 세포 표면 현장지도를 얻을 수 Cy5 채널에서 젤 스캔.
4. DeCyder 사용하여 두 개의 현장지도를 2 - D 소프트웨어를 함께 매치하고 싸이 오 표시된 세포 표면 단백질에 해당하는 모든 장소에 대한 선택 목록을 만들 수 있습니다. Ettan 명소 처리 스테이션을 사용하여 세포 표면 단백질을 선택, 겔 플러그에서 추출하고, Ettan의 소화조를 사용하여 trypsinate. 든 - TOF 질량 분광법을 사용하여 식별합니다.

표 1. Ettan DIGE 실험은 그림 1에있는 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜에 따라 분류 혈청 고갈 세포의 샘플을 사용하여 수행되었습니다.

단백질 농도

두 상표 워크플로우의 개요는 그림 1에 표시됩니다. 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜에 따라 분류하면 세포가 그대로 있기 때문에, 단지 세포 표면 단백질이 염색에 노출되어 있습니다. 세포 내부뿐만 아니라 외부 라벨 부착 및 단백질은 (그림 1) 표시되기 전에 표준 Ettan DIGE 프로토콜에서는, 세포가 lysed 있습니다. 세포 - 표면 단백질이 특별히 quantitated 수 없으므로 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜에 단백질 색소의 상대적 금액은 알 수 없다. 그러나, 그것은 세포 표면 단백질은 세포 ^단백질이 매우 낮은 비율을 구성하는 것이 알려져 있습니다. 염료 600 pmol에 약 50-10 X10 ⁶ 셀 사용되었습니다. 그것은이 연구에서 nonfractionated 샘플만을 12.5-25 %가 2 - D 전기 영동에 사용되는 시절부터 적은 세포를 사용할 수 있습니다.

그림 1. 워크플로우 프로토콜을 라벨링의 개요

다른 분수의 단백질 농도는 2 - D 퀀트 키트를 사용하여 결정됩니다. 10 X10 ⁶ CHO - K1 세포에서 파생된 총 단백질의 금액 이외 fractionated 예제에서는 920 μg, cytosolic / 친수성 분획에서 멤브레인 / 소수성 분획과 770 μg의 225 μg되었습니다. 이 금액은 대부분 세포 종류와 세포 크기에 따라 달라집니다. 세포 표면 프로토콜 레이블 아르 단백질의 비율은 전체 단백질로부터 2-3 %를 표준 Ettan DIGE 최소한의 라벨보다 높을 수 있습니다. 그것은 자리 모양이 젤에서 낮은 분자 단백질의 원형과 세로 줄이 있기 때문에 하나의 염료 분자가, 단백질 분자 당 (그림 2 및 3) 결석 첨부 것 같습니다. 단백질 당 두 더 많은 염료 분자가 표시된 단백질의 분자량 증가에 따라 수직으로 줄이을 일으킬 것입니다. 이러한 단백질의 분자량의 변화가 높은 분자량의 단백질에 비해 젤에 큰 변화 초래 하리라는 사실 때문에 이러한 현상은 주로, 낮은 분자량의 단백질로 볼 것입니다.

셀 - 표면 단백질 특정 라벨링

세포의 두 동일한 샘플 표면 CyDye DIGE 플루어 Cy3으로 표시되었습니다. 하나는 lysed 2 - D 전기 영동에 직접 사용되었다. 다른 예제는 lysed와 막과 cytosolic 분수에 fractionated되었습니다. 전체 형광 라벨은 멤브레인 분율에 출연, cytosolic 분율은 표시된 단백질 (그림 2)은없는되었습니다. cytosolic 단백질 샘플과 동일한 겔은 은빛 스테인드되었으며 결과는 겔에 단백질이 것을 보여주지만, 그들은 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜을 사용하여 표시되지 않았습니다. 이러한 결과는이 새로운 상표 프로토콜은 세포 표면 단백질에 대한 구체적인 것이 좋습니다. CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료는 세포막을 통해 세포 또는 패스를 입력하지 않는 것 같습니다. 세포 전에 라벨에 얼음을 보관하고 이것이 세포막에 걸쳐 모든 전송을 줄일 수 있습니다. CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료의 노출 시간은 단백질 라벨뿐만 아니라 휴대 입국 충분한지, 또한 (20 분) 상대적으로 짧습니다. 세포 안쪽 라벨의 부족을위한 또 다른 가능한 설명은 염색이 막 전역 통과하더라도, 세포 내부의 산도가 발생하는 효율 라벨 반응 (최적 pH는 8.5)을 (<산도 7.4) 너무 낮은 것입니다. 라벨 반응은 세포가 lysed 후에 추가하는 단백질 라벨을 방지하는 세포의 세탁 다음 침묵이다. 이 방법이 성공적으로 체외에서 인간의 세포 라인뿐만 아니라 생체내 ⁷ 복잡한 생물 학적 시스템에 적용되었습니다.

그림 2. 세포 - 표면 단백질 라벨의 특이성.

CHO - K1 세포의 cellsurface 단백질은 Cy3와 fractionated으로 표시되었습니다. 다른 분수는 (A) 2 - D 전기 영동에 의해 분리와 Cy3 형광 검사되었습니다. 동일한 젤 그런 다음 실버 스테인드 (B)되었습니다.

분류

nonfractionated 샘플 (그림 2)와 비교하여 멤브레인 - fractionated 샘플에 대한 현장 패턴에서만 약간 차이가 있습니다. 두 현장지도도 아닌 fractionated 샘플에 존재했다 DeCyder 2 - D 차동 분석 소프트웨어와 막 분획에서 검색된 모든 장소를 사용하여 비교했다. 분별화 따라서, 세포 표면 단백질의 탐지를 개선하기 위해 필요한 것이 아니라 세포 내부 단백질의 라벨링의 부족을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜 간의 비교

새로운 세포 표면 프로와 장점을 평가할 수 있도록tein 라벨 프로토콜 표준 Ettan DIGE 프로토콜과 비교이 수행되었다. 같은 술병 속에서 자란 CHO - K1 세포에서 두 개의 동일 시료는 각각 두 개의 다른 프로토콜 (그림 1)과 병렬로 표시되었습니다. 세포 표면 Cy5 레이블 샘플은 Cy3 표시 셀 lysate와 같은 겔에서 실행되었습니다. 겔에 녹색 반점 (Cy3)는 (그림 3A) 멤브레인 분별화 다음 표준 Ettan의 DIGE 절차를 사용하여 표시된 단백질을 나타냅니다. 이러한 장소는 아마도 세포 표면 단백질뿐만 아니라 세포 내부의 점막 (ER, 잠돌군 Zz, mitochondrion, 그리고 핵)에서 단백질을 포함 멤브레인 단백질입니다. 그것이 낮은 풍부한 세포 표면 단백질을 검출을위한 최고의 확률을 제공해야부터 막 분획화 단계 다음 표준 Ettan DIGE 라벨 절차는 비교를 위해 선택되었다. 젤 (그림 3A)에 붉은 반점 (싸이 5) 표준 분류 절차 (녹색 반점)로 표시되지 않은 새로운 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜을 사용하여 레이블이 특정 단백질을 세포 표면입니다. 또한, 노란 반점 중 하나 절차 (그림 3A)를 사용하여 두 샘플에서 발생하는 중복 단백질을 나타냅니다. 또 다른 유용한 응용 프로그램은 세포 세포막에있는에서 세포 표면에 단백질을 구별하기 위해 두 라벨링 프로토콜을 결합하는 것입니다. 또한, 세포의 표면 / 막 단백질 수준의 다양한 자극 이후에 상대적인 변경 사항에 대한 정보를 동시에 분류 기술을 사용하여 다음 수 있습니다.

그림 3.

(A)의 2 차원 젤 이미지 CHO - K1 Cy5 세포 - 표면 레이블 샘플 (빨간색 반점, 프로토콜 1, 그림 1 참조)과 막 fractionated Cy3 샘플 (녹색 반점, 프로토콜 2, 그림 1 참조)에 따라 표시 표준 Ettan DIGE 프로토콜은 동일한 2 - D 젤에서 실행됩니다. (B) DeCyder 2 - D의 표준 Ettan DIGE 프로토콜을 사용하여 보이지 않는 세포 표면 단백질 레이블을 보여주는 2 - D 겔에서 차동 분석 소프트웨어 전망.

세포 표면 단백질의 식별

현장 패턴라는 세포 표면 샘플 및 총 단백질 라벨 샘플 사이에 차이가 있기 때문에 그것은 스파이크가 일치하고 예비 명소지도에서 세포 표면 명소의 신분을 활성화라는 세포 표면을 포함시킬 필요했습니다. 모든 세포 표면 단백질이 포착되었습니다. 세포 표면 단백질들은 낮은 풍요로움으로 인해 식별하기 어려울 수 있습니다. 어떤 장소에서 실제 단백질 금액은 세포 표면 단백질이 풍부한 시각 육체적으로이 프로토콜을 사용하여 풍부한 않으므로 식별 불충분 수 있습니다. 낮은 풍부한 세포 표면 단백질의 성공적인 식별을 촉진하기 위하여, 총 단백질의 예비 금액은 2 - D 전기 영동에 응용하기 전에 막 단백질에 대한 풍부하게하실 수 있습니다. 이러한 CHO 세포에서 세포 멤브레인 단백질 및 세포 표면 단백질은 세포의 전체 단백질의 약 20 %를 구성합니다. 이러한 세포 유형은 장소에있는 단백질 금액은 잠재적으로 막 단백질의 농축에 의한 요인 5 증가 수 있습니다. 또한, IPG 스트립의 좁은 기울기 산도 간격의 사용은 많은 양의 단백질의 응용 프로그램을 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 막 단백질에 대한 강화, 그리고 광범위한 범위 IPG 스트립과 함께 단 600 μg의 총 단백질를 사용했습니다. 우리는 여전히 82%는 이전에 다음 ID로 멤브레인 관련 단백질로 알려진되었던의 세포 표면 단백질의 큰 번호를 식별할 수 있었다.

멀티플렉싱

세 염료 ^6, 혈청 고갈 CHO 세포에서 샘플 일련의 다른 시간 지점 (표 1)에서 수집된 및 세포 표면 단백질은 라벨이 붙지만를 사용 Ettan의 DIGE 실험에서 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜을 테스트하려면. 샘플 2 - D 전기 영동에 의해 분리되었다. 세포 표면 DIGE 실험을위한 내부 표준의 준비 간단합니다. 이 경우에는 싸이이 세포 표면에 표시된 샘플 (모든 시간 지점에서) 풀링되었으며 각 2 - D 겔에 적용된 내부 표준으로 사용됩니다. 세 CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료가 표시 세포 표면 (데이터가 표시되지 않음) 마찬가지로 단백질. 세포 표면 단백질의 많은 혈청 기아 동안 표현의 변화는 DeCyder 2 - D 소프트웨어를 (그림 4)를 사용하여 감지되었습니다.

그림 4.

CHO - K1 세포의 기아 동안이 세포 표면 단백질의 표현으로 변경합니다. 스팟지도 DeCyder 2 - D 차동 분석 소프트웨어를 사용하여 분석했다.

결론

세포 표면 단백질 라벨에 대한 새로운 Ettan DIGE 프로토콜은 U로 신속, 간단하게SE 및 세포 표면 단백질을 라벨에 대한 매우 구체적인. 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜을 사용할 때 많은 소설 세포 표면 단백질만을 감지합니다. CHO 세포에 대한 80 개 이상의 새로운 세포 - 표면 단백질은 DeCyder 2 - D 차동 분석 소프트웨어를 사용하여 감지되었습니다. 확인된 세포 표면에 라벨 명소의 80 % 이상 멤브레인 관련 단백질되었습니다.

멀티플렉싱은 세 CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료를 사용하여 달성하고, DeCyder 2 - D 소프트웨어 조합이 새로운 프로토콜은 2 - D DIGE 기술 획득의 모든 장점과 함께 세포 표면 단백질을 연구를위한 강력한 도구입니다.