Étiquetage sélective des protéines de surface cellulaire utilisant CyDye DIGE Fluor Colorants Minimal

La culture cellulaire

1. Cultivez ovariennes de hamster chinois (CHO-K1) en utilisant les procédures standard de culture de cellules dans un milieu de Ham F-12 avec glutamax I contenant 10% sérum de veau foetal, 50 U / ml de pénicilline, et 50 ug / ml de sulfate de streptomycine (Invitrogen).
2. Bourse du milieu de culture pour un milieu sans sérum. Marquer les protéines de surface de la cellule ont été à des moments différents avec CyDye DIGE Fluor Cy3 ou Cy5 colorants minime (voir la section marquage de surface cellulaire, plus bas).
3. Piscine nombres égaux de cellules provenant de chaque point du temps et de l'étiquette avec CyDye DIGE Cy2 Fluor. Utilisez-les comme une norme interne pour chaque gel 2-D.
4. La majorité des expériences peuvent être réalisées avec des cellules CHO-K1, mais fibroblastes d'embryon de souris (3T3 L1) et les lymphoblastes de lymphome de souris ascite (EL4) peut également être utilisé (données non présentées).
5. Cultivez les deux types cellulaires derniers dans le milieu DMEM avec glutamax II, mais, sinon, utilisez des conditions identiques utilisé pour les cellules CHO-K1.

L'étiquetage de la surface cellulaire

1. Détacher soigneusement cellules adhérentes non enzymatique, en comptant et en divisant en aliquots de 5-10 x 106 cellules. Pour les cellules en croissance en suspension, omettre l'étape détacher.
2. Centrifuger les suspensions cellulaires à environ 800 xg pendant 5 minutes. Retirez les surnageants contenant le milieu.
3. Laver les pastilles par resuspendion dans la Solution 1 ml de glace froide saline équilibrée de Hank (HBSS) pH 8,5. Centrifugées à 800 xg à 4 ° C pendant 2 minutes.
4. Enlever le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de tampon de glace étiquetage froide culot (HBSS pH 8,5, 1 M d'urée).
5. Étiqueter les cellules intactes avec 600 pmol colorants CyDye Fluor DIGE minimale de 20 minutes sur la glace dans l'obscurité.
6. Arrêter la réaction en ajoutant 20 pl 10 mM de lysine. Incuber pendant 10 minutes.
7. Lavez la surface cellules marquées à deux reprises par la remise en suspension dans 500 ul de HBSS pH 7,4, suivie par une centrifugation à 800 xg à 4 ° C pendant 2 minutes.

La lyse cellulaire et le fractionnement

1. Lyse la surface cellules marquées dans 150 ul de tampon de lyse froid (7 M d'urée, 2 M thiourée, CHAPS 4%, 30 mM Tris, 5 mM d'acétate de magnésium pH 8,5). Laisser sur la glace pendant au moins 1 h avec vortex occasionnel.
2. Centrifuger les lysats à 10 000 xg à 4 ° C pendant 5 minutes. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Cet échantillon est l'échantillon non fractionnée contenant toutes les protéines cellulaires.
3. En parallèle, se laver les culots de cellules, comme ci-dessus, puis fractionnent (en utilisant un kit de fractionnement sur membrane, Pierce) dans la membrane et les fractions cytosoliques avant 2-D électrophorèse sur gel. La fraction membranaire des cellules internes et contient des protéines membranaires de surface.
4. A titre de comparaison, suivent la norme Ettan DIGE procédure ^3, et Lyse, l'étiquette, et, enfin, fractionner les cellules. Déterminer la concentration de protéines dans les échantillons en utilisant le 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).

Électrophorèse 2-D

1. Réhydrater les gels DryStrip Immobiline, pH 3-11NL (24 cm) en utilisant le bac DryStrip Immobiline Reswelling, 24 cm en 450 solution de réhydratation DeStreak ul (0,5% IPG tampon) pendant la nuit.
2. Appliquer le CyDye échantillons marqués (correspondant à 50 ug de protéines totales) à Immobiline gels DryStrip par le chargement de la Coupe anodique dans le collecteur et d'effectuer la focalisation isoélectrique (IEF) en utilisant Ettan IPGphor II IEF système conformément aux instructions.
3. Après l'IEF, à équilibrer les bandes en deux étapes et placer sur le dessus de la grande (26 x 20 cm) des gels de polyacrylamide 12,5% (SDS-PAGE). Superposition avec 0,5% d'agarose (à vide tampon contenant du bleu de bromophénol). Exécuter électrophorèse 2-D en utilisant Ettan DALTtwelve gros système vertical à 5 ​​W / gel pendant 30 min, puis à 15 W / gel jusqu'à ce que le front atteint le fond du gel.

Imagerie et analyse des données

1. Après avoir terminé électrophorèse 2-D, de numériser les gels pour les Cy2, Cy3 ou Cy5 l'aide d'un typhon 9410 Imager mode Variable.
2. Comparer les cartes place à partir des fractions membranaires, les fractions cytosoliques, et non fractionnée en utilisant des échantillons DeCyder 2-D Logiciel d'analyse différentielle ^4.

Post-coloration

1. Après l'imagerie, coloration à l'argent des gels selon la procédure standard ^5.

L'identification des protéines

1. Cultiver, récolter, laver et Lyse quantités préparative (environ 1 mg de protéines totales de 10 cellules CHO x106) des cellules, comme décrit ci-dessus pour un échantillon non fractionnée. Utilisez un échantillon de surface des cellules étiquetées Cy5 (voir ci-dessus) comme un pic, et appliquer ainsi que les montants non étiquetés préparative des protéines.
2. Effectuer l'électrophorèse 2-D comme décrit ci-dessus, mais cette fois, aplly 600 mg de cellules non étiquetées lysat avec 50 mg de surface des cellules étiquetées par des pointes anodiques tasse de demande. Utilisez des marqueurs de référence pour permettre la cueillette bon endroit, et le lieu serontentre les plaques de verre avant la coulée du gel, conformément aux recommandations ^3.
3. Analyser le gel dans le canal Cy5 pour obtenir la carte Cy5 surface cellulaire au comptant, suivie d'une coloration des protéines totales à l'aide de Deep Purple Stain protéines totales ^3.
4. Match ensemble, les deux cartes utilisant le spot DeCyder 2-D de logiciels et de créer une liste de sélection pour tous les spots correspondant aux 5 Cy étiquetée protéines de surface cellulaire. Choisissez des protéines de surface cellulaire utilisant la station de traitement Ettan repérer, d'extraire à partir des bouchons de gel, et trypsinat utilisant le digesteur Ettan. Identifier par spectrométrie de masse MALDI-TOF.

Tableau 1. Une expérience Ettan DIGE été réalisée en utilisant des échantillons de sérum de cellules appauvri étiquetés selon le protocole de surface cellulaire de protéines d'étiquetage dans la figure 1.

La concentration en protéines

Un aperçu des deux flux d'étiquetage est montré dans la figure 1. Puisque les cellules sont encore intactes lorsque étiquetés selon le protocole de surface cellulaire de protéines étiquetage, seules les protéines de surface cellulaire sont exposés à la teinture. Dans le protocole standard Ettan DIGE, les cellules sont lysées avant l'étiquetage et les protéines à l'intérieur comme à l'extérieur de la cellule sont étiquetés (Fig 1). La quantité relative de colorant à la protéine dans le protocole de la protéine de surface cellulaire étiquetage n'est pas connue, puisque protéines de surface cellulaire ne peut pas être quantifié précisément. Cependant, il est connu que les protéines de surface cellulaire constituent une très faible proportion des protéines cellulaires ^2. Environ 5-10 x10 ⁶ cellules à 600 pmol de colorant ont été utilisées. Il peut être possible d'utiliser moins de cellules puisque seulement 12,5 à 25% de l'échantillon non fractionnée dans cette étude a été utilisé pour l'électrophorèse 2-D.

Fig 1. Vue d'ensemble des protocoles d'étiquetage workflow

Les concentrations en protéines dans les différentes fractions ont été déterminés en utilisant le kit de 2-D Quant. Le montant total provenant des protéines 10 x10 ⁶ cellules CHO-K1 a été mg 920 dans l'échantillon non fractionnée, 225 mg dans la membrane mg / fraction hydrophobe et 770 dans la fraction cytosolique / hydrophile. Ces montants seront très probablement varier selon le type cellulaire et la taille des cellules. La proportion de protéines qui sont marqués dans le protocole de surface cellulaire peut être plus élevé que la norme d'étiquetage DIGE Ettan minime, ce qui est de 2-3% des protéines totales. Il semble que seule une molécule de colorant est fixé par molécule de protéine, puisque la forme spot est stries verticales rondes et des protéines de faible masse moléculaire sur les gels est absent (fig. 2 et 3). Deux et plus les molécules de colorant par protéine causerait stries verticales dues au poids moléculaire accru de la protéine marquée. Ce phénomène serait surtout être vu avec les protéines de faible poids moléculaire, car un changement de poids moléculaire de ces protéines se traduirait par une plus grande évolution sur le gel par rapport à protéines de haut poids moléculaire.

Cell-surface de la protéine étiquetage spécifique

Deux échantillons identiques de cellules en surface étaient étiquetés avec CyDye DIGE Fluor Cy3. Un été lysées et utilisé directement pour électrophorèse 2-D. L'autre échantillon a été lysées et fractionné en fractions membranaires et cytosoliques. L'étiquette fluorescente paru dans la fraction membranaire, la fraction cytosolique était dépourvue de toute protéines marquées (Fig. 2). Le gel même avec l'échantillon de protéine cytosolique a été colorés à l'argent et le résultat a montré qu'il y avait des protéines dans le gel, mais ils n'étaient pas étiquetés en utilisant le protocole protéines de surface cellulaire étiquetage. Ces résultats suggèrent que ce protocole nouvel étiquetage spécifique pour les protéines de surface cellulaire. Le CyDye DIGE Fluor colorant minimum ne semble pas entrer dans la cellule ou de passer à travers la membrane cellulaire. Les cellules sont conservés sur la glace avant de l'étiquetage et cela peut réduire les transports à travers la membrane. Le temps pour CyDye DIGE Fluor exposition minimale de teinture est aussi relativement courte (20 minutes), ce qui est suffisant pour l'étiquetage des protéines, mais pas pour l'entrée dans la cellule. Une autre explication possible pour l'absence d'étiquetage à l'intérieur de la cellule est que même si le colorant passe à travers la membrane, le pH à l'intérieur de la cellule est trop faible (pH <7,4) pendant une réaction de marquage efficace pour produire (pH optimal 8,5). La réaction de marquage est éteint suivi d'un lavage des cellules, ce qui empêche encore toute marquage des protéines après que les cellules ont été lysées. Cette méthode a été appliquée avec succès à des lignées de cellules humaines in vitro ainsi que d'un système biologique complexe in vivo ^7.

Fig 2. Spécificité de l'étiquetage des protéines de surface cellulaire.

Les protéines cellsurface des cellules CHO-K1 ont été marqués avec Cy3 et fractionné. Les différentes fractions ont été séparées par électrophorèse 2-D et de la fluorescence Cy3 scannés pour (A). Les mêmes gels ont ensuite été colorés à l'argent (B).

Fractionnement

Il ya seulement des différences mineures dans le schéma spot pour l'échantillon de membrane fractionnée par rapport à l'échantillon non fractionnée (Fig 2). Les deux cartes sur place ont été comparés en utilisant DeCyder 2-D Logiciel d'analyse différentielle et tous les spots détectés dans la fraction membranaire, étaient également présents dans l'échantillon non fractionnée. Fractionnement, par conséquent, n'est pas nécessaire d'améliorer la détection des protéines de surface cellulaire, mais peuvent être utilisés pour vérifier l'absence de marquage des protéines dans les cellules.

Comparaison entre les protocoles

Pour être en mesure d'évaluer les avantages avec la surface de la cellule de nouvelles proTEIN étiquetage protocole, une comparaison avec le protocole standard Ettan DIGE a été effectuée. Deux échantillons identiques de cellules CHO-K1 cultivés dans le même ballon étaient étiquetés en parallèle avec les deux protocoles différents, respectivement (figure 1). Une surface cellulaire Cy5 échantillon marqué a été exécuté sur le même gel comme un lysat de cellules étiquetées Cy3. Les taches vertes (Cy3) sur le gel (figure 3A) représentent les protéines marquées en utilisant la procédure standard de DIGE Ettan suivie d'un fractionnement de membrane. Ces taches sont vraisemblablement des protéines membranaires dont les protéines de surface cellulaire ainsi que des protéines des membranes intérieur de la cellule (ER, Golgi, mitochondrie, et le noyau). Standard Ettan procédure de labellisation DIGE suivie par une étape de fractionnement de membrane a été choisi à titre de comparaison, car elle doit donner la plus grande probabilité de détecter la faible abondance des protéines de surface cellulaire. Les taches rouges (Cy 5) sur le gel (figure 3A) sont des protéines de surface des cellules spécifiques marqués à l'aide de la surface des cellules nouvelles marquage des protéines protocole qui ne sont pas visibles à la procédure d'étiquetage standard (taches vertes). En outre, les taches jaunes représentent les protéines qui se chevauchent et se produisent dans les deux échantillons en utilisant soit la procédure (figure 3A). Une autre application utile serait de combiner les deux protocoles d'étiquetage pour distinguer les protéines à la surface cellulaire de ceux sur les membranes intracellulaires. Par ailleurs, des informations sur les changements relatifs au niveau de la protéine de surface cellulaire / membrane après divers stimuli pourrait être suivie en utilisant les deux techniques de marquage simultanément.

Fig 3.

(A) images de gel 2-D d'une CHO-K1 Cy5 surface cellulaire échantillon étiqueté (taches rouges, voir protocole 1, Fig 1) et une membrane fractionnée Cy3 échantillon (taches vertes, voir le protocole 2, figure 1) étiqueté conformément aux standards Ettan DIGE protocole exécuté dans le même gel 2-D. (B) 2-D DeCyder vues différentiel Logiciel d'analyse du gel 2-D montrant une protéine de surface cellulaire étiquetés pas visible en utilisant la norme Ettan DIGE protocole.

Identification des protéines de surface cellulaire

Depuis le modèle spot est très différente entre une surface de cellules étiquetées échantillon et un échantillon de protéines totales étiquetés, il était nécessaire d'inclure une surface de la cellule étiquetée pic pour permettre à l'appariement et l'identification des taches de surface cellulaire dans la carte des spots de préparation. Toutes les protéines de surface cellulaire ont été cueillis. Protéines de surface cellulaire peuvent être difficiles à identifier en raison de leur faible abondance. La quantité de protéine réelle dans certains endroits peut être insuffisant pour l'identification, puisque les protéines de surface cellulaire sont visuellement enrichies et pas physiquement enrichi en utilisant ce protocole. Pour faciliter l'identification réussie de faible abondance des protéines de surface cellulaire, les montants de préparation de protéines totales peut être enrichi pour des protéines membranaires avant l'application sur électrophorèse 2-D. Dans ces cellules CHO, les protéines membranaires intracellulaires et les protéines de surface cellulaire constituent environ 20% des protéines totales dans les cellules. Pour ce type de cellule, la quantité de protéines dans les endroits susceptibles d'être augmenté par un facteur 5 par l'enrichissement des protéines membranaires. En outre, l'utilisation d'intervalles étroits gradient de pH des bandes IPG permettra l'application de grandes quantités de protéines. Dans cette étude nous avons utilisé seulement 600 mg de protéines totales, avec aucun enrichissement pour des protéines membranaires, et une bande large éventail IPG. Nous étions toujours en mesure d'identifier un grand nombre de protéines de surface cellulaire, dont 82% étaient déjà connus comme les protéines associées à membrane.

Multiplexage

Pour tester la surface des cellules marquage des protéines de protocole dans une expérience DIGE Ettan utilisant tous les trois colorants ^6, une série d'échantillons de cellules CHO sérum appauvri ont été recueillies et protéines de surface cellulaire étiquetés à des moments différents (tableau 1). Les échantillons ont été séparés par électrophorèse 2-D. La préparation d'un standard interne pour une expérience DIGE surface cellulaire est simple. Dans ce cas, Cy 2 échantillons de surface des cellules étiquetées (de tous les temps) ont été regroupées et utilisées comme standard interne appliqué à chaque gel 2-D. Surface de la cellule tous les trois colorants CyDye DIGE Fluor minimale protéines marquées de façon similaire (données non présentées). Les changements dans l'expression lors de la famine de sérum pour de nombreuses protéines de surface cellulaire ont été détectés à l'aide DeCyder 2-D de logiciels (figure 4).

Fig 4.

Changement dans l'expression de deux protéines de surface cellulaire lors de la famine des cellules CHO-K1. Cartes spot ont été analysées par DeCyder 2-D du logiciel d'analyse différentielle.

Conclusions

Le nouveau protocole pour Ettan DIGE marquage des protéines à la surface cellulaire est rapide, simple à usoi et hautement spécifique pour le marquage des protéines de surface cellulaire. Beaucoup de nouvelles protéines de surface des cellules ne sont détectables que lors de l'utilisation du protocole de surface cellulaire de protéines d'étiquetage. Plus de 80 nouvelles protéines de surface cellulaire pour les cellules CHO ont été détectés à l'aide DeCyder 2-D Logiciel d'analyse différentielle. Plus de 80% des spots identifiés surface de la cellule ont été étiquetés protéines membranaires associées.

Le multiplexage est réalisé en utilisant les trois CyDye DIGE Fluor colorants minimes, et en combinaison avec DeCyder 2-D de logiciels, ce nouveau protocole est un outil puissant pour étudier les protéines de surface cellulaire avec tous les avantages obtenus grâce à la technologie 2-D DIGE.