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 JoVE Biology

Suportados Bicamadas Planar para a Formação do Estudo da Sinapses imunológicas e Kinapse

1, 1

1Helen and Martin S. Kimmel Center for Biology and Medicine at the Skirball Institute of Biomolecular, New York University - NYU

Article
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    Summary

    Suportados bicamadas planar são ferramentas poderosas que podem ser usados ​​para modelar as interações moleculares em uma sinapse imunológica. Aqui, vamos mostrar os métodos de ancoragem de proteínas de adesão celular que modula a formação de sinapses para o folheto superior do bilyer lipídico e visualize a formação de sinapses através de microscopia TIRF.

    Date Published: 9/15/2008, Issue 19; doi: 10.3791/947

    Cite this Article

    Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

    Abstract

    Suportados bicamadas planar são ferramentas poderosas que podem ser usados ​​para modelar as interações moleculares em uma sinapse imunológica. Para simular as interações entre linfócitos e células apresentadoras de antígenos, usamos Ni2 +-quelante lipídios para ancorar adesão celular e proteínas recombinantes MHC o folheto superior de uma bicamada com poli-histidina tags. Bicamadas planas são gerados através da preparação de lipídios, o tratamento de superfícies de vidro, onde a bicamada formará, e então formar a bicamada em uma câmara especializada contendo uma célula de fluxo onde os linfócitos serão adicionados. Então, bicamadas são acusados ​​de Ni e sua marcadas proteínas recombinantes são adicionados. Finalmente, os linfócitos são injetados na célula de fluxo e microscopia TIRF pode ser usado para formação da imagem sinapse e os mecanismos que controlam a locomoção de células T, sites de classificação receptor, e os locais de degradação receptor.

    Protocol

    1. Preparar os lipídios

    1. A fim de ligar proteínas para o folheto superior de uma bicamada, usamos Ni 2 + lipídios quelante, que escora proteínas recombinantes com poli-histidina tags. Certos tipos de células podem aderir não especificamente para bicamadas + revestido Ni 2, mas as células T, geralmente, não, tornando este método ideal para estudar a ativação de células T.
    2. A solução bicamada lipídica é feita através da preparação de uma solução de Ni 2 + 20% de lipídios e 80 quelante fosfatidilcolina% no montante adequado a um tubo de vidro com 1-2 ml de clorofórmio-metanol.
      1. Evaporar o solvente sob um fluxo de gás nitrogênio em um ambiente aconchegante (30-37 ° C) em banho maria. Isso normalmente leva cerca de 15 minutos.
      2. Remover qualquer traço do solvente sob alto vácuo, usando um liofilizador por 90 minutos.
    3. Dissolver os lipídios em 2% N-octil-glucoside detergente em tampão Tris-salina, o que cria uma solução de mistura detergente / fosfolipídio micelas. A concentração de fosfolipídios final deve ser 0,4 mM. Para formar os lipossomas, diálise esta solução com três mudanças de Tris-salina para remover lipossomas detergente e forma. Costumamos trabalhar com volumes da ordem de 1 ml com 6 mm de diâmetro Spectra / por # 2 tubos com um corte em torno de 10 kDa. Temos o cuidado de excluir qualquer bolha de ar quando s de fixação da tubulação. Nós normalmente estéril-filtro esta solução e fazer a diálise em condições limpas, manuseá-lo usando luvas de etanol 70% esterilizados.
    4. Esta solução deve ser cristalina. Ela é armazenada sob gás argônio para evitar a oxidação. Se a solução estiver turva, então multi-walled vesículas foram gerados, e você terá que começar novamente.

    2. Determinar a quantidade de ICAM-1 e MHC são depositados no bicamada planar

    1. , A fim de configurar o experimento, é necessário primeiro determinar o quanto ICAM-1 e MHC são depositados em uma área determinada superfície de Ni 2 + quelante bicamada em uma dada concentração de proteína solúvel. Para fazer isso, bicamadas depósito em 5 micrômetros de diâmetro contas de vidro, incubar as esferas de vidro com soluções de proteínas em condições que se aproximem daquelas nas células de fluxo usado para geração de imagens, e ler a densidade de proteínas ligadas por um fluxo de ensaio imunofluorométrico.
    2. Anticorpos marcados com FITC-número conhecido de fluoresceína por molécula são usados ​​para detectar as proteínas de superfície-bound. Contas de fluoresceína padrão são usados ​​para calibrar o fluxo de microfluorimeter.
    3. Vamos estabelecer as condições que se aproximem daquelas em células apresentadoras de antígenos, com 200 molecules/μm2 de ICAM-1 e 0,2-20 molecules/μm2 de I-Ek-MCC91-103 complexos.

    3. A limpeza da lamínulas de vidro para a formação de bicamadas planar

    1. Bicamadas planas formam espontaneamente quando o lipossomas fusível de vidro, mas só se o copo está devidamente limpo.
    2. Ao trabalhar com Piranha, usamos roupas de proteção total, incluindo um avental de ácido e pesado, ácido luvas resistentes. Cuidadosamente segregar os resíduos a partir de resíduos orgânicos e descartar adequadamente.
    3. Para preparar a solução de ácido Piranha, adicione 75 ml de ácido sulfúrico concentrado a um recipiente seco e, cuidadosamente, adicionar 25 ml de peróxido de hidrogênio 30%. A solução rapidamente se aquece para mais de 100 ° C.
    4. Mergulhe as lamelas seco na solução por 15 minutos. Remover da solução e enxaguar em água purificada por um minuto em cada lado. Seca as lamelas utilizando uma fonte de vácuo para drenar a água purificada. Permitir que a solução Piranha para esfriar, e adicionar ao recipiente de resíduos Piranha, que fica com a tampa solta, bem marcado na capela. Quando todos os lipossomas, lamínulas, e as proteínas são preparados, a sinapse imunológica está pronto para ser formado.

    4. Formando o bicamadas

    1. Para formar a bicamadas, nosso laboratório utiliza Bioptechs FCSII câmaras, que têm as vantagens de aquecimento integrado. O sistema FCSII está em uma base de aço inoxidável que grampos em conjunto um coletor microfluídicos com uma junta de 0,5 mm de topo, um slide microaqueduct revestido com óxido de índio e estanho para o aquecimento em uma superfície, com sulco fluídico do outro lado, um livre de poeira 0,25 milímetros junta que define a altura da câmara de fluxo ea Piranha limpos lamela 40 mm redondo em que a bicamada é formada.
    2. Enquanto a lamínula, em que a bicamada é formada, precisa ser altamente hidrofílico e limpo, o slide microacqueduct realmente funciona melhor se é mais hidrofóbica. Tornando o mais hidrofóbico microaqueduct é alcançada após o tratamento com HSA 1% por 60 minutos em temperatura ambiente, em seguida, lavar com água pura e secagem completamente após este processo de condicionamento, bem como entre os usos. O revestimento de proteínas desnaturadas deixadas por este procedimento permite que 1 ml de suspensão de lipossomas para formar um círculo, hemispherical gota que é> 0,25 mm de altura.
    3. Para montar a célula de fluxo e formar bicamadas planar, coloque o manifold, com os tubos direccionado para cima, em cima de uma superfície plana. Então, coloque a 0. 5 junta mm com furos posicionado sobre os tubos fluídico, certificando-se que ele esteja bem encaixada. Delicadamente, coloque o lado microaqueduct para a junta com os canais fluídicos voltada para cima, e certifique-se que assentos lisos sem aplicar qualquer pressão para baixo, até verificar que os buracos no slide se alinham com os tubos microfluídicos. Coloque o livre de poeira junta 0,25 mm com um corte retangular no topo do slide microaqueduct para que o canal está alinhado com os canais fluídicos e que não existem espaços de ar maiores.
    4. Coloque até 5 x 1 gotas mL de suspensão de lipossomas na superfície da lâmina microaqueduct em um padrão tal que a distância de centro a centro entre cada gota é de 2,5 mm. A 5 gotas lipossomas podem ter composições diferentes, mas neste caso só vamos formar duas bicamadas, um sem Ni 2 + + lipídios quelante e um com 10% Ni 2 + + lipídios quelante.
    5. Uma vez que estas gotas estão no lugar, coloque cuidadosamente a tampa de deslizamento sobre a superfície em um movimento. Pinça para a base o mais rápido possível. As gotas lipossomas devem fazer contato com a lamínula. Este contato não deve ser quebrado, já que o bicamadas provavelmente já formado; qualquer interrupção pode resultar em bicamadas com defeito.
    6. É importante lembrar para marcar as posições das bicamadas com algumas pequenas manchas de tinta no slide microacqueduct para auxiliar na colocação da lamela no microscópio. Esperar 20 minutos para se certificar de que o sistema tenha equilibrada. Transferência de todas as soluções usando uma seringa de 20 ml conectada a cerca de 20 cm de tubos flexíveis e uma torneira de 3 vias. Conectar outra porta da torneira para a célula de fluxo por um curto período de tubulação para minimizar o volume morto entre a torneira ea célula de fluxo. Encha a seringa com HEPES-salina tamponada contendo 2 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 5 mM de glicose e 1% albumina sérica humana.
    7. Primeiro-tubo e torneira para que não haja bolhas de ar. Conecte-o ao fluxo de células e empurrar a 5 ml em um movimento, enquanto observa a certeza de que nenhuma bolha de ar passar sobre a bicamada. Agora, você terá a sua bicamadas.

    Este artigo de vídeo suporta "Hunter Gatherer e para trás: Sinapses imunológicas e Kinapses como variações sobre o tema da Locomotion Amoeboid" por Michael L. Dustin , Revisão Anual de Biologia Celular e do Desenvolvimento , Volume 24, 2008.

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    Comments

    3 Comments

    Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 3, 2009, 11:42 AM

    Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 20, 2009, 8:19 AM

    Thanks for your response.
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 9, 2009, 5:34 AM

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