Erstellung und Pflege von Spinalganglien Neuronen in Compartmented Kulturen

Vorbereitung der Reagenzien

1. Collagen-Beschichtung: Kollagen Mantel p35 Zellkulturplatten und in einem Ofen bei 37 ° C für 2 Tage vor dem Schmieren der Teiler. Die endgültige Konzentration von Kollagen sollten bei 0,71 mg / ml in .001 N HCl verdünnt werden. Dann fügen Sie 1 ml der Mischung pro Platte.
2. Fett Lader: Um das Fett loader zu füllen, eine 60 ml Spritze muss zunächst mit Corning Vakuum Fett gefüllt werden. Verwenden Sie die Spritze mit dem Fett-Loader zu füllen, wickeln Sie es in Folie und dann Autoklaven für 45 Minuten.
3. Teflon Teiler: die Teiler kann nach jedem Experiment wieder verwendet werden, sondern muss zuerst gründlich gereinigt werden. Entfernen Sie die Teiler von der Platte, wischen Sie alle verbleibenden Fett und in Schwefelsäure für 2 Tage. Nach dem Entfernen aus der Säure mit Wasser 3X, Kochen gründlich für 20 Minuten trocknen lassen, in ein Glas p100 Petrischale und Autoklaven für 20 Minuten.
4. N2-Methylcellulose: abwiegen 1,5 g Methylcellulose und legen Sie es in einer 500ml Flasche. Fügen Sie einen Rührstab und Autoklaven für 20 Minuten auf dem Trockenen (ab diesem Zeitpunkt alle Arbeiten müssen steril sein). Als Nächstes fügen Sie 500 ml serumfreiem Medium (N _2), und rühren Sie in einem kalten Raum, bis sie sich auflöst. Aliquot in 50 mL konische und Einfrieren bei -20 ° C. Für die Arbeit Lager, Aliquot einer der 50 mL konische in 1 ml Tuben und bei -20 ° C.
5. DRG-Medien: DMEM, 5% hitzeinaktiviertem Pferdeserum und 1% Penicillin Streptomycin.
6. 100ng/mL DRGN Medien: Die Aktie Konzentration beider nerve growth factor (NGF) und brain-derived neurotrophen Faktor (BDNF) ist 1mg/ml. Verdünnen Sie jede der Neurotrophine 1:10.000 in den DRG-Medien. Kulturen können in NGF allein angebaut werden, dies ändert die Ergänzung von Neuronen, die in den Kulturen überleben.
   
   Hinweis: Bei Bedarf wird die Konzentration von (Cytosinarabinosid) AraC 1um und verwendet in einer Endkonzentration von 0.3uM. Dies hemmt das Wachstum von Schwann-Zellen und anderen Gliazellen.
   
   
7. 10ng/ml DRGN Medien: Verdünnen Sie die 100ng/mL DRGN Medien (1:10) mit DRG-Medien.
   
   
   
   
   Abbildung 1. Werkzeuge für die Set-up benötigt
   

Einrichten des compartmented Kammern (Beginn dieses Prozesses 1-2 Tage vor der Dissektion)

1. Machen Sie einen Kratzer in der Mitte eines Kollagen beschichtet p35 Schüssel mit einer passiven Bewegung.
2. Legen Sie 30ul der N2-Methylcellulose auf die Mitte des kratzen. Set Geschirr beiseite, bis Teiler ist gefettet.
3. Bringen Sie eine 23-Gauge-Luer-Steckadapter, um das Fett-Loader. Fassen Sie die Teflon Teiler mit einem Paar 90 °-Winkel Hämostatika und legen Sie es mit dem Teiler nach oben unter dem Mikroskop. Verfolgen Sie die Trennlinie mit Fett dafür sorgen, dass jedes Mal, wenn Sie den Adapter an einem neuen Ausgangspunkt der Adapter in das Fett aus dem vorherigen Schritt eingefügt wird so platziert, dass es eine kontinuierliche Reihe von Fett (siehe Diagramm). Sobald das Fett auf die gesamte Teiler angewendet wird, drehen Sie einen der vorbereiteten p35 Gerichte auf den Kopf und legen Sie sie so die N2-Methylcellulose ist über dem mittleren Fach. Drücken Sie auf den Boden der Schale mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, auf der Innenseite des Teilers in vier Ecken (oben links, unten rechts, oben rechts, unten links, im Diagramm durch "X" gekennzeichnet) drücken.
   
   
   
   Abbildung 2: Schritte zum Einfetten der Teiler
   
   Hinweis: Es ist wichtig, fest genug drücken, so dass das Fett eine vollständige Abdichtung mit dem Teller macht, aber wenn zu viel Druck hinzugefügt wird, die Axone nicht in die Seitentaschen überqueren.
   
   Nehmen Sie den Hämostatika, umdrehen und Ausspannen der Teiler. Schließlich legen Sie die Schale mit dem Teiler fest unter dem Mikroskop mit Schwerpunkt auf der Unterseite der mittleren Fach angebracht. Mit der Fett-Loader, machen Sie eine kleine Barriere (.25 cm), so dass, wenn die Zellen in der mittleren Fach gestellt werden können sie nicht auslaufen.
4. Nachdem mehrere Kulturen, Ort DRG Medien in jedem der seitlichen Fächern und in einen Inkubator, in dem die Zellen aufrechterhalten werden eingestellt. Lassen Sie den Kulturen für mehrere Stunden sitzen und prüfen Sie dann auf Dichtheit prüfen. Wenn das Medium in das mittlere Fach ausgelaufen sind, dann wird die Kultur unbrauchbar.
   
   Hinweis: Beim ersten Erlernen dieser Technik ist es wichtig, mehr Kulturen als für ein Experiment benötigt, da mehrere werden undicht.
   
   
   
   Abbildung 3: "Good vs leaky" Kultur
   

Die Aufrechterhaltung DRG-Neuronen in compartmented Kulturen

1. Tag 1: Ersetzen DRG Medien in den Seitentaschen mit 100ng/mL DRGN media + AraC. Führen Sie Dissektion und Zellen hinzufügen, um Fach-Center (100.000 Zellen).
2. Tag 2: Add 10ng/ml media + AraC auf der Außenseite des Teflon Teiler, bis die Medien fließt über die Fett-Schranke und der Austausch Flüssigkeit mit der Fach-Center.
3. Tag 3: Ersetzen Medien in den Seitentaschen zu 100ng/mL DRGN Weglassen des AraC und die Surround mit 10ng/ml DRGN Weglassen des AraC.
4. Tag 6: Ersetzen Medien in den Seitentaschen zu 1ng/mL + AraC und die Surround mit DRG media + AraC.
5. Tag 9: Verwenden Sie für Experimente.
   
   
   
   
   Abbildung 4: IHC Bilder Zellkörper und Axone distal
   
   
   
   Hinweis: Beim Wechsel der Medien, ist es wichtig, die Flüssigkeit aus der Spitze der einzelnen Seitenfach absaugen. Auch ändern sich nie die Medien aus dem mittleren Fach selbst, sondern nur aus den Surround, und lassen Sie es über die Fett-Schranke in das Zentrum fließen.
   

In diesem Video haben wir gezeigt, wie man sich vorbereiten und pflegen compartmented Kammern für den Einsatz in Kultivierung DRG-Neuronen. Alles richtig, dieses System Trennung der Zellkörper aus dem Axon, um Mechanismen, durch die Neurotrophine Signal über lange Axone zu studieren. Da es fluidische Trennung zwischen den Fächern, ermöglicht es zur selektiven Stimulation oder Behandlung von einem Fach, ohne die anderen Fächer berührt wird. Compartmented Kammer Kulturen unterstützt auch andere Zelltypen, einschließlich sympathischen Neuronen von der überlegenen Halsganglien, retinalen Ganglienzellen Neuronen und kortikalen Neuronen. Spatial Verständnis der Neurotrophin Signaltransduktion können neue Einblicke in Behandlungen von neurodegenerativen Erkrankungen bieten. Mehrere neurodegenerativen Erkrankungen, darunter Alzheimer, Chorea Huntington und Motoneuronerkrankung sind mit Defekten in axonalen Transport verbunden. Jüngste Studien haben mikrofluidischen Kammern statt dieser compartmented Kammern verwendet. Die mikrofluidischen Kammern ^4,5 haben mehrere Vorteile für die Bildanalyse.

Frühere Studien haben die Fähigkeit dieser Kulturen eine Diffusion zwischen dem Axon und Zellkörper Fach ^1,3,6 verhindern getestet. Dies kann leicht durch Zugabe von geringen Konzentrationen eines Farbstoffes wie Trypanblau, um ein Fach nur, und suchen Sie nach Diffusion des Farbstoffes getestet werden. Es sollte wenig oder keine Diffusion sichtbar innerhalb von 24 Stunden.