Aislamiento y cultivo de Post-Natal células de ratón cerebelosa gránulo Progenitor neuronas y las neuronas

Parte 1: Configuración (1-2 días antes de la disección) (No se muestra el vídeo)

1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES CULTURA Y MEDIOS DE COMUNICACIÓN:
   • 4X CMF-PBS-EDTA (calcio y magnesio libre de tampón fosfato salino-EDTA para las diluciones de Percoll) por litro, agregar 32 g de NaCl, 1,2 g KCl, 8 g de glucosa, 2 g de NaH ₂ PO _4, 1 g KH ₂ PO _4, 8 ml 2% NaHCO stock _3, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) a agua destilada / desionizada. Ajuste el volumen a 1 litro y el pH a 7,4. Filtro de esterilización.
   • HBSS-glucosa: glucosa Añadir (6 gramos / litro) de calcio y magnesio Solución libre salina equilibrada de Hank (HBSS) y un filtro estéril. 500 ml se pueden almacenar a 4 ° C durante un máximo de un mes.
   • MEDIOS DE CULTIVO: medio libre de suero (SFM) y el 10% medio FBS. A 48 ml de Neurobasal A-Media añadir 500 l 100X Glutamax I, 500 l 100X penicilina-estreptomicina (final de 100 unidades de penicilina y estreptomicina 100 mg), 6,25 l 2 M KCl (final de 250 mM). Dividida en 2 partes alícuotas de 9 ml y 40 ml. Para preparar el 10% medio FBS, añadir 1 ml de SFB inactivado por calor a la parte alícuota de 9 ml. Para preparar la ordenación forestal sostenible, añadir 800 l de los suplementos de suero libre de B-27 a la alícuota de 40 ml. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C por un máximo de 2 semanas. Para obtener mejores resultados que los medios de comunicación nuevos para cada experimento.
2. Preparar las diluciones de Percoll:
   • Percoll se presenta como un líquido y debe ser acidificada antes de su uso. Para preparar el caldo, agregar HCl 1N, poco a poco a la solución de Percoll durante un período de 1-2 horas hasta pH 7,4 se alcanza. Añadir el HCl demasiado rápido hará que el Percoll al conjunto. Aproximadamente 6.5ml de HCl 1 N se necesitan por cada litro de Percoll. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C.
   • Un 35% y un 60% (vol: vol) de dilución Percoll se utilizará en el paso gradiente de Percoll. Preparar 100 ml de Percoll diluciones que contiene 35 o 60 ml de Percoll de valores, 25 ml de 4X CMF-PBS-EDTA y agua destilada / desionizada H2O para el volumen final. Añadir unas gotas de azul de toluidina para la solución del 60%, sino que le ayudará a visualizar la interfaz y las células. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C.
   • 4X CMF-PBS-EDTA no deben ser mayores de 3 meses, como búfer insuficiente causará la muerte celular aumentó durante el procedimiento.
3. Cubreobjetos PREPARACIÓN: cubreobjetos de cristal (mejor si es de Carolina Biological Supply Company) se lavan con HCl 10% durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave, enjuagar con agua destilada / deonized agua y almacenados en etanol al 70%. Antes de usar, solo se llama cubreobjetos esterilizados por brevemente la celebración con unas pinzas sobre una llama abierta (mechero Bunsen) hasta que se evapore el etanol. 12 mm cubreobjetos de vidrio se pueden colocar en placas de cultivo de 4 bien y cubreobjetos de 25 mm en placas de cultivo de 6 pocillos.
4. BUQUES DE LA CULTURA DE RECUBRIMIENTO CON SOPORTE: Para la tinción de inmunofluorescencia o tratamientos farmacológicos cubreobjetos de vidrio son más adecuados, ya que pueden ser fácilmente montados en portaobjetos de vidrio para la visualización en el microscopio. Cuando un gran número de células necesarias para la recogida de muestras de ARN o de proteína, las células pueden ser cultivadas en la cultura de plástico dishes.The noche antes de la disección, cubreobjetos de vidrio o platos de plástico para la cultura deben ser recubiertas con poli-D-lisina (500 mg / ml; 800 l / pocillo para placas de 6 pocillos o 350 l / pocillo de 4 placas). 5 mg / ml de solución stock de poli-D-lisina se almacena a -20 ° C, después se diluyó en agua destilada estéril / deonized el agua y el derecho de filtrado estéril antes de su uso. Recipientes de cultivo se incuba a 37 ° C durante la noche (o por lo menos durante 2 horas antes de la chapa) y se lavó dos veces con el derecho de agua destilada estéril / deonized de las placas,.
5. La preparación de platos PREPLATING: Estos platos serán utilizados para pre-revestimiento de las células del cerebelo aislado antes del cultivo para eliminar los contaminantes gliales, que se adhieren más fácilmente a una menor concentración de sustrato. Dos capas de 60 mm placas de cultivo de plástico con 4 ml por placa de poli-D-lisina (100 ug / ml; Nota: esta es 1 / 5 de la concentración utilizada para el cultivo). Se incuba a 37 ° C durante la noche (o por lo menos durante 2 horas antes de la disección). Justo antes de la disección, se retira la solución de poli-D-lisina, lavar los platos dos veces con agua estéril y dejar secar en la campana.
6. Esterilizar las herramientas de disección en el autoclave o en el día de la disección, sumerja los instrumentos en el 70% de etanol durante 20 minutos. Herramientas necesarias: unas tijeras Permaset, tijeras microdissecting, cuatro Dumont # 5 pinza de disección.

Parte 2: Preparación para la disección (día de la disección) - (demostrada en el vídeo)

Todos los procedimientos siguientes se realizan en una campana de cultivo de tejidos a menos que se.

1. Limpie el área de disección con etanol al 70%. Caliente los medios de comunicación a 37 ° C en un baño de agua o en un 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C.
2. Cuando se inicia un nuevo sistema de papaína disociación Kit (Worthington), preparar la solución de albúmina ovomucoide inhibidor. Agregar 32 mlde EBSS (solución salina balanceada de Earle, en el kit) a la mezcla de inhibidor de la albúmina ovomucoide y permitir que los contenidos se disuelven, mientras que la preparación de los otros componentes. Reconstituir en la primera utilización, guarde la solución restante a 2-8 º C y utilizar hasta los cinco aislamientos permitido por cada kit se han completado.
3. Añadir 5 ml de EBSS al vial de la papaína uno de los kit de disociación (cada vial es suficiente para la disociación de 4 a 15 cerebelo de postnatal día 5 ratones). Coloque el vial de la papaína en un 5% de CO ₂ 37 ° C o incubador de 37 ° C baño de agua durante 5 a 10 minutos hasta que la papaína se disuelva por completo y la solución parece clara. Mantener la solución a temperatura ambiente durante la disección.
4. Añadir 500 l de EBSS a un vial DNasa del kit de disociación. Mezclar suavemente tocando el vial desde DNasa es sensible a la desnaturalización de corte. Añadir 250 l de esta solución en el vial que contiene la papaína (concentración final es de 20 unidades / ml papaína y el 0,005% DNasa). Guarde el resto de vial DNasa para su uso en el paso 5.1 o 6.1.

Parte 3: Disección y eliminación de las meninges

1. La edad óptima para el cultivo de células granulares de ratones C57BL/6J es después del día 06/04, cuando el número de células progenitoras de células granulares de la EGL peaks1, 10. Diseccionar las crías de una en una, y como que se familiarice más con la disección del cerebelo tratar de reducir el tiempo de la disección a no más de 6 minutos por cada cachorro. La velocidad es la esencia.
   Si el paso se pasa por alto gradiente de Percoll, ocho días después del parto-5 crías de ratón puede producir suficientes células de una placa de cultivo de 6 pocillos (o seis de 25 mm cubreobjetos) o por seis placas de cultivo de 4 bien (o veinticuatro 12 - mm cubreobjetos). Rendimiento aproximado es de 4 a 5x106 células por la densidad de cría y de las planchas puede variar entre 1 y 5x105 células/cm2. Dado que las células del 15-20% se pierden durante el Paso 4 Percoll, más animales se necesitan para obtener la misma densidad deseada de la célula.
2. Pipeta de 15 ml de HBSS-glucosa en un 60 mm plato de plástico de cultivo de tejidos y de 10 ml en una estéril Falcon 15 ml tubo de plástico cónico. Poner en hielo.
3. Fuera de la campana, limpie la cabeza del cachorro con el 70% de etanol. Use las tijeras Permaset para decapitar al cachorro. (La decapitación no será mostrado en el video.)
4. En la capilla, sostener la cabeza con unas pinzas Dumont de modo que usted puede ver claramente la parte posterior del cráneo. El acceso al cerebro mediante la inserción de tijeras microdissecting dentro del foramen magno y el corte en línea recta hacia los ojos. Con unas pinzas, retire la piel y levantar el cráneo para exponer el cerebro. El uso de pinzas Dumont, pellizcar el cerebelo y el mesencéfalo rodea y su transferencia a la fuente con HBSS-glucosa. (Es más fácil de manipular el cerebelo y eliminar las meninges si el cerebelo está todavía en el tejido circundante).
5. Bajo el microscopio de disección, suavemente pelar las meninges de la cerebelo y también entre los lóbulos con una multa Dumont # 5 fórceps durante el uso de las pinzas de anclaje a otros por el cerebelo a la placa. Usted se dará cuenta de los vasos sanguíneos en la superficie del cerebelo. Estos vasos sanguíneos son una buena manera de identificar las meninges. Quite la meninges hasta el cerebelo tiene un aspecto blanco mate. Separar el cerebelo desde el resto del cerebro medio. A su vez a su lado ventral y eliminar el plexo coroideo, que se parece a una cinta de color rojizo entre el cerebelo y el mesencéfalo ventral adyacente. Coloque cada cerebelo en frío HBSS-glucosa en un tubo cónico de 15 ml en hielo tan pronto como disecados. Cambie la solución de disección a un nuevo HBSS-glucosa después de la disección de tres cerebros.

Parte 4: Suspensión celular

1. Una vez que todas las disecciones se termine, quite el HBSS-glucosa desde el tubo y reemplazarlo con la solución de papaína en el paso 2.4. Aunque el equipo recomienda cortar el tejido en trozos pequeños, nos encontramos con que no es necesario cortar o picar el cerebelo a esta edad. Coloque el tejido + solución de papaína (en un tubo cónico de 15 ml) en un 37 ° C baño de agua o 5% de CO ₂ 37 ° C incubadora durante 15 a 20 minutos. De 4 a 8 cerebelo, a 15 minutos a 37 º C es suficiente para un mayor número de cerebelo 20 a 30 minutos es mejor. Agite suavemente el tubo cada 3 a 4 minutos.
2. Triturar la mezcla con una punta de la pipeta estéril p1000 aerosol que ha sido recubierto con FBS. Hacer este paso con cuidado para evitar que la formación de burbujas de aire. Pipetas de vidrio pulido de incendios se puede utilizar, pero nos encontramos con que el suero estéril recubierta p1000 consejos aerosol funcionan igual de bien. Para cubrir la punta de la pipeta con el FBS, FBS pipeta hacia arriba y abajo dos veces antes de usar. Alrededor de 10 movimientos arriba y abajo con la pipeta son suficientes para disociar el tejido. La solución se enturbie. Permitir la suspensión de sentarse por 30-60 segundos para que los trozos grandes de tejido no disociado se asentará en el fondo del tubo.
3. Eliminar las células en suspensión (cuidado de no quitar las piezas de tejido no disociado en el bottom) en un nuevo tubo de 15 ml cónicos con una pipeta de punta recubierta de suero. Se centrifuga a aproximadamente 200xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Prepare la resuspensión medio. Para ello, mezcla de 2,7 ml EBSS con 300 l de solución reconstituida inhibidor de la albúmina ovomucoide en un tubo estéril. Añadir 150 ml de solución de DNasa en el paso 2.4.
4. Después de centrifugar, descartar el sobrenadante e inmediatamente resuspender el botón celular en los gases de DNasa / inhibidor de la solución de albúmina preparada en la etapa 4.3 con un suero recubierto p1000 aerosol punta de la pipeta.
5. Preparar un gradiente de densidad discontinuo de la siguiente manera. Añadir 5 ml de solución de inhibidor de la albúmina ovomucoide a un tubo cónico de 15 ml. Cuidadosamente la capa de células en suspensión en la parte superior. Se centrifuga a aproximadamente 70xg durante 6 minutos a temperatura ambiente. Disociada precipitar las células en la parte inferior del tubo, fragmentos de membrana permanecen en la interfaz.
6. Si desea obtener cultivos que se enriquecen en las células granulares, evitar el gradiente de Percoll paso de separación (que produce cultivos puros de células granulares del cerebelo), y proceder a la parte 6. Si desea aislar aún más a las células granulares de la glía y las interneuronas grandes por la separación de gradiente de Percoll, proceder a la parte 5. El uso del paso gradiente de Percoll reduzca el rendimiento de las células. En nuestras manos, la reducción en el rendimiento es de aproximadamente 20-35%. Sin embargo, hay un aumento en el enriquecimiento de las neuronas granulares y las células progenitoras de aproximadamente el 90% al 95-99%.

Parte 5: Separación gradiente de Percoll

1. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado inmediatamente en 2 ml de HBSS-glucosa con 50 l de DNasa de paso 2.4. Filtrar la suspensión de células a través de una malla de nylon (tamaño de poro 70 micras) por la gravedad. Este paso eliminará grandes células no neuronales, y prevé una suspensión de células más simple.
2. Prepare dos pulido fuego de vidrio pipetas Pasteur. Para ello, llama suavemente la punta de una pipeta de vidrio hasta que el borde se suaviza y el agujero pipeta es de 40-50% del tamaño original. Tenga cuidado de no hacer que la abertura muy pequeña.
3. Prepare gradiente de Percoll. Colocar 10 ml de solución de Percoll al 35% en un tubo cónico de 50 ml estéril. 60% de Percoll (10 ml) se carga en una jeringa de 10 ml estéril con una aguja estéril adjunta la columna vertebral. Suavemente la capa de Percoll al 60% por debajo de la solución de solución al 35%, mediante la adición de la solución al 60% en la parte inferior del tubo con la aguja espinal. Tenga cuidado de mantener una interfaz clara entre las dos capas. Añadir a las células a la parte superior de la pendiente con una pipeta pulida al fuego, añadir suavemente a lo largo del lado del tubo sin molestar a la interfaz.
4. Con cuidado, coloque el tubo de la centrífuga y centrifugar a 1800xg. Rampa hasta la velocidad de un paso cada 20 segundos (incrementos de velocidad son los siguientes: de aproximadamente 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg) de modo que dura aproximadamente 2 minutos para alcanzar la velocidad deseada. Iniciar el temporizador de 10 minutos, cuando se alcanza 1800xg. Cuando haya terminado, disminuir la velocidad poco a poco a un paso cada 20 segundos.
5. Eliminar la interfaz superior de la pendiente (que contiene las células de grandes, las células de Purkinje y las interneuronas) y descarte.
6. Retire con cuidado las células en la interfase entre el 35% y el 60% de Percoll con una pipeta pulida al fuego y la transferencia a un tubo cónico de 50 ml. Resuspender en 3 volúmenes de HBSS-glucosa y mezclar invirtiendo varias veces. Centrifugar durante 5 minutos a 1100xg.
7. Eliminar el sobrenadante y añadir 4 ml de 10% medio FBS con 50 l de DNasa. Resuspender el precipitado con cuidado usando una pipeta pulida al fuego para formar una suspensión de células individuales. Continúe con el paso 6.2.

Parte 6: Pre-placas y Revestimiento

1. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado inmediatamente en 4 ml de 10% medio FBS con 50 l de DNasa en el paso 2.4. Filtrar la suspensión de células a través de una malla de nylon (tamaño de poro 70 micras) por la gravedad. Este paso eliminará grandes células no neuronales, y prevé una suspensión de células más simple.
2. Placa de las células recogidas en un poli-D-lisina recubierto pre-revestimiento plato durante 20 minutos en un 5% de CO ₂ 37 ° C incubadora. Repita el procedimiento con un plato dulce. Las células astroglía y más pesado se calmará y se adhieren a los platos y dejar a las neuronas granulares pequeñas y células neuronales progenitoras flotante. Después de la incubación, libremente adheridas las neuronas granulares y las células progenitoras neuronales son desalojados fácilmente y afloja con suaves golpecitos de la placa.
3. Recoger las neuronas granulares y las células progenitoras de neuronas en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 200xg durante 5 minutos. Resuspender el precipitado en 1 ml de medio libre de suero y el recuento de una alícuota de 10 l con un hemocitómetro.
4. Añadir medio libre de suero para llegar a la densidad celular deseada. Las guías para el número de células a la placa de media densidad: de placas de 6 pocillos, 3,5 a 4 millones de células, de las placas de 4 pocillos, 650.000 células. De 6 y placas de cultivo, que la placa de 1,5 ml / pocillo y 4, así pla-tes, que la placa de 0,5 ml / pocillo. Las células se mantienen en un 5% de CO ₂ 37 ° C incubadora. Cambiar el medio por completo 24 horas más tarde con los cambios subsiguientes se celebrarán cada dos o tres días.

Este protocolo se basa en modificaciones de los procedimientos que se han descrito en el pasado ^3,7,11. Hay varios puntos importantes que tenga en cuenta como veremos a continuación.

Las neuronas granulares y las células progenitoras se adhieren a las 2 horas de la siembra. Las células sanas tienen una morfología redonda bajo el ⁴ microscopio de contraste. Dentro de 24 horas después de la siembra, las células sanas se distribuye uniformemente en todo el cubreobjetos o el plástico y así se forma los procesos. En el momento del cambio de medio en primer lugar, a las 24 horas, habrá unas cuantas células que flotan muertos. Esto es normal, ya que algunas células se mueren o se enferman durante el proceso de disociación. Sin embargo, si después de 48 horas las células se agrupan junto a las varices en sus procesos, ya sea que las células son poco saludables o el sustrato de poli-D-lisina es tóxico. Como con la mayoría de los sustratos, la eficacia de la poli-D-lisina es muy dependiente y cada nuevo lote debe ser probado. Las imágenes de las culturas saludables se pueden encontrar en las referencias de ^4,11, y ^20. Las células sanas se pueden mantener en cultivo durante un máximo de dos semanas ^8.

Progenitores gránulo neuronas comienzan a diferenciarse en placas ^8,12,13,14. Una vez que la densidad de la galvanización óptima se ha establecido para sus estudios, que debe mantenerse, ya que la proliferación es promovida por factores tales como la señalización de Notch ^15, y las células se proliferan más en densidades más altas. La proliferación de progenitores neuronales de gránulos pueden ser sustancialmente más prolongada mediante la adición de sonic hedgehog (Shh) al medio de ^12,13,14. Laminina también se pueden añadir como substrato, además de poli-D-lisina para promover el crecimiento de las neuritas ^16,17. Estas características de la cultura de células granulares ofrecer un sistema para el estudio de la biología o de las neuronas granulares o la regulación de la diferenciación de las células progenitoras de neuronas en ^6,18,19.

Aislaron las células del cerebelo de ratones postnatales son inicialmente compuesto por una mezcla de las neuronas granulares y células progenitoras de neuronas granulares en las diferentes etapas del ciclo celular ^8. También hay astroglía y las interneuronas presentes en la soledad / la cultura y la purificación de las neuronas granulares y progenitores gránulo (95% -99%) se obtiene mediante la separación en gradiente de Percoll ^4. Células enriquecidas gránulos obtenidos sin el uso de la etapa de separación gradiente de Percoll se han utilizado para estudiar la regulación de la proliferación y diferenciación de células progenitoras de neuronas granulares, ^18,19,20. En corroboración de esto, encontramos que las células en la población aislada por pasar por el gradiente de Percoll paso de separación responder con firmeza a Shh, permaneciendo en el ciclo celular por varios días, y que sin la adición Shh, hay muy poca proliferación en los cultivos como se indica por tinción con el fabricante de la proliferación celular, Ki67. Sin embargo, si los cultivos se van a utilizar más allá de varios días in vitro, se recomienda que el paso gradiente de Percoll se incluirán para disminuir la contaminación de las neuronas granulares por la proliferación de células no neuronales.