Summary
Wir beschreiben eine einfache, schnelle und robuste Methode für die Bildung von
Abstract
Candida albicans bleibt die häufigste Ursache von Pilzinfektionen in einem expandierenden Bevölkerung gefährdet Patienten und Candidiasis ist jetzt das dritte häufigste Infektion in US-Krankenhäusern. Unterschiedliche Erscheinungsformen von Candidiasis sind mit Biofilmbildung, sowohl auf dem Host-Gewebe und / oder medizinische Geräte (zB Katheter) verbunden. Biofilmbildung führt negativen klinischen Folgen, wie Zellen innerhalb des Biofilms von der Host-Immunantwort und durch die Einwirkung von Antimykotika sind geschützt. Wir haben eine einfache, schnelle und robuste In-vitro-Modell für die Bildung von C entwickelt albicans Biofilmen mit 96 well Mikrotiterplatten, die auch für Biofilm antimykotische Antibiogramm eingesetzt werden können. Die Anzeige dieses Tests kolorimetrisch, basierend auf der Reduktion von XTT (a Tetrazoliumsalz) durch metabolisch aktive Pilz Biofilm-Zellen. Ein typisches Experiment dauert ca. 24 h für die Bildung von Biofilmen, mit einer zusätzlichen 24 h für antimykotische Empfindlichkeitsprüfung. Aufgrund seiner Einfachheit und die Verwendung von allgemein verfügbaren Labor-Materialien und Geräte, demokratisiert diese Technik Biofilm-Forschung und stellt einen wichtigen Schritt in Richtung Standardisierung der antimykotischen Empfindlichkeitstestung von Pilzen Biofilmen.
Protocol
1. Vorbereitung von C. albicans
C. albicans ist ein Risk Group 1/BSL1 Mikroorganismus. Denken Sie daran, gute aseptische / sterile Techniken für die Arbeit die Verwendung mit diesem Mikroorganismus und folgen institutionellen Verfahren für die ordnungsgemäße Entsorgung von biologischem Risikomaterial.
- Bereiten Sie eine Übernachtkultur von C. albicans in YPD (Yeast Peptone Dextrose) flüssigen Medium durch Animpfen einer Einzelkolonie von C. albicans in 25 ml YPD.
- Inkubieren Kultur in einem Schüttler (ca. 180 rpm) bei 30 ° C über Nacht. Die meisten C. albicans Stämme werden als Hefezellen unter diesen Bedingungen wachsen.
- Zentrifugieren Sie die Nacht-Kulturen (etwa 3.000 rpm, 5-10 Minuten), waschen Sie die Zellen zweimal mit sterilem PBS und Resuspendieren die endgültige Pellet in ca. 20-25 ml RPMI 1640-Medium mit 165 mM morpholinepropanesulfonic Säure auf pH 7,0 und vorgewärmte gepuffert bei 37 ° C (von nun an dieses Medium einfach als "RPMI 1640" genannt).
- Zählen von Zellen mit Hilfe eines Hämazytometer. Nach dem Zählen Herstellung einer Suspension von Zellen zu einer endgültigen Dichte von 1,0 x 10 6 Zellen / ml in RPMI 1640.
Hinweis: Da Zellen eine Tendenz zur Aggregation haben, ist es wichtig, kräftig vortexen zwischen Waschen und vor dem Pipettieren.
2. Einrichten des 96-well Mikrotiterplatten für die Bildung des Biofilms
- Mit einer Mehrkanal-Pipette 100 l von C. albicans Suspension in ausgewählten Wells der 96-well Mikrotiterplatten (-s). Fügen Sie keine Zellen in die Vertiefungen in Spalte 12, da diese als negative Kontrollen dienen wird.
- Decken die gesamte Mikrotiterplatte mit seiner ursprünglichen Deckel, Dichtung mit Parafilm, statt in einen Inkubator und inkubieren für 24 h bei 37 ° C. Die Länge der Inkubation kann auf die spezifischen experimentellen Design angepasst werden. Zum Beispiel ist es möglich, die Kinetik der Bildung von Biofilmen über einen Zeitraum von 24 zu untersuchen - 48 Stunden durch Impfen mehrere Platten und-verarbeitung jede Platte zu verschiedenen Zeitpunkten (dh 2, 4, 8, 12, 24 und 48 h)
- Nach Bildung von Biofilmen, mit einer Mehrkanalpipette Saugen Sie das Medium sorgfältig wie nicht zu berühren und zu stören den Biofilmen, die in jede der Vertiefungen gebildet haben.
- Mit einer Mehrkanal-Pipette Platten dreimal in sterilem PBS (200 ul pro Well). Alternativ können Sie eine automatisierte Mikrotiterplatte Unterlegscheibe. Zwischen wäscht, und besonders nach dem letzten waschen, abtropfen lassen die Platten in einer umgekehrten Position durch Abtupfen mit Papiertüchern, um restliche PBS zu entfernen. An dieser Stelle Biofilme bilden auf dem Boden der Vertiefungen muss deutlich sichtbar sein, auch mit dem bloßen Auge und kann auch visualisiert werden mit einem inversen Mikroskop (Abbildung 1). Biofilme sind nun bereit, für antimykotische Empfindlichkeitsprüfung Assays verarbeitet werden.
(Wenn der Hauptzweck des Experiments auf das Ausmaß der Bildung von Biofilmen zu beurteilen, werden die Platten bereit, verarbeitet mit der kolorimetrischen Methode. Dazu wird der XTT / Menadion-Reagenz (siehe Schritt 3 unten) hinzugefügt werden können und die resultierende Farbe Lesen mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät).
3. Antifungal Empfindlichkeitsprüfung von Biofilmen
- Ab Lager-Lösungen oder Pulver, bereiten eine funktionierende Lösung in RPMI 1640-Medium der einzelnen Antimykotika getestet werden. Typische hohen Konzentrationen sind 1.024 pg / mL für Fluconazol und 16 pg / mL für Amphotericin B und Caspofungin. Andere Konzentrationen können für unterschiedliche Mittel eingesetzt werden.
- Mit einer Mehrkanal-Pipette 200 ul des hohen Arbeitsdruck Konzentration von Antimykotika in die entsprechenden Wells in Spalte 1 jeder Mikrotiterplatte mit Pilz-Biofilmen.
- 100 l RPMI 1640 in jede Vertiefung in den Spalten 2 bis 10.
- 100 l RPMI 1640 in die Vertiefungen in Spalte 11.
- Nehmen Sie 100 ul Antimykotikum aus den Vertiefungen der Säule 1 und ergänzen die benachbarten Vertiefungen in Spalte 2 (bereits mit 100 ul Medium).
- Mischen Sie den Inhalt gut durch Auf-und Abpipettieren mit einer seriellen Verdoppelung Verdünnung durchführen, und entfernen Sie die Tipps.
- Wiederholen Sie die Bewegung nach rechts, bis die Vertiefungen der Spalte 10, nach dem die letzten 100 ul-Volumen aus den Vertiefungen der Säule 10 nach dem Mischen wird verworfen. Auf diese Weise haben eine Reihe von Verdoppelung Verdünnungen von Ihrem Agenten (-s) von Interesse geschaffen worden, von den meisten in Vertiefungen der Spalte 1 bis mindestens konzentriert in Vertiefungen der Spalte 10 konzentriert. Unangefochten Biofilmen in Spalte 11 wird als positive Kontrollen dienen und leere Brunnen in Spalte 12 wird als negative Kontrollen dienen.
- Bedecken Sie den Teller mit den Lidern, Dichtung mit Parafilm und inkubieren für 24 -48 h bei 37 ° C.
- Nach der Inkubationszeit waschen die Platten wie in Schritt 2.4 vor (3 x PBS).
- Mit einer Mehrkanal-Pipette werden 100 ul des XTT / Menadion Lösung in jede Vertiefung mit einem Pre-washed Biofilm sowie negativen Kontroll-Wells für die Messung der Hintergrund XTT-kolorimetrischen Ebenen.
- Der XTT ist eine gesättigte Lösung bei 0,5 g / L in steriler Ringer-Laktat, PBS oder Kochsalzlösung, die sich als Filter-sterilisiert mit einem 0,22 um-Filter mit einer Porengröße Bedürfnisse vorbereitet. Der XTT-Lösung ist lichtempfindlich, daher sollte es mit Alu-Folie während der Vorbereitung abgedeckt werden. Nach der Vorbereitung und Filter-sterilisiert, Aliquot in 10 mL Arbeitsvolumen und bei -70 ° C. Schützen Sie die Rohre von Licht mit Aluminiumfolie. Thaw nur so viele Röhren als für ein bestimmtes Experiment kurz vor dem Gebrauch notwendig.
- Menadion als 10 mM Stammlösung in 100% Aceton, in kleineren Mengen (ca. 50 mL) aliquotiert und bei -70 ° C hergestellt Bereiten Sie die XTT / Menadion Lösung kurz vor Gebrauch durch Zugabe von 1 ul der Stammlösung von Menadion in ein Röhrchen mit 10 ml des aufgetauten XTT-Lösung.
- Decken Sie die Platten in Alufolie und im Dunkeln inkubieren für 2 h bei 37 ° C.
- Entdecken Sie die Platten. Mit einer Mehrkanal-Pipette abnehmen 80 ul der resultierenden gefärbten Überstand aus jeder Vertiefung und Transfer in die entsprechenden Vertiefungen einer neuen Mikrotiterplatte.
- Lesen Sie die Platte (-s) in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 490 nm.
- Berechnen Sie die sessile minimalen Hemmkonzentrationen SMIC50 und SMIC80, die antimykotische Konzentrationen, bei denen eine 50% bzw. 80% Rückgang in kolorimetrischen Messungen im Vergleich zu den Kontrollbiofilmen in der Abwesenheit von Antimykotikum gebildet (in diesem Fall Werte für Spalte 11 erfasst werden, , auch nicht vergessen, um Werte aus negativen Kontrollen subtrahieren aus Brunnen in Spalte 12 mit XTT only). SMIC Ergebnisse können als Tabelle (dh mehrere Stämme gegen mehrere Antimykotika) oder alternativ für jeden einzelnen Pilz zu isolieren gegeneinander Antimykotika können als Diagramm durch Auftragen prozentuale Hemmung gegenüber antimykotische Konzentration präsentiert wird.
Beispiel: Nach Abzug der Werte in der negativen Kontrolle, ist die durchschnittliche OD der Kontrolle Biofilmen in Spalte 11 gebildet 1,32. Die SMIC50 ist die niedrigste antimykotische Konzentration führt zu> 50% ige Reduktion der kolorimetrischen Lesungen, in diesem Fall weniger als 1,32 x 50/100 = 0,66. Ebenso ist die SMIC80 den niedrigsten antimykotische Konzentration führt zu> 80% ige Reduktion der kolorimetrischen Lesungen, in diesem Fall weniger als 1,32 x 20/100 = 0,264.
4. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt eine Mikrophotographie einer C. albicans Biofilm gebildet auf dem Grund eines Brunnens in einer 96-well Mikrotiterplatten aufgenommen mit einem inversen Mikroskop. Abbildung 2 zeigt XTT-kolorimetrische Messungen (OD 490-Werte) für je 11 Biofilme der C. albicans Wildtyp-Stammes in jedem der 8 verschiedenen Zeilen der gleichen 96-well Mikrotiterplatte gebildet. Abbildung 3 zeigt die Aktivität von Amphotericin B bei unterschiedlichen Konzentrationen gegen C. albicans Biofilmen; Pfeile zeigen SMIC50 und SMIC80 Werte.
Abbildung 1. (A) Panel A zeigt eine Mikrophotographie aufgenommen mit einer Kamera an einem inversen Mikroskop eines C. albicans Biofilm auf der Unterseite des Brunnens nach Aspiration von RPMI-Medium und anschließende Waschen mit PBS gebildet. (B) A-Aufnahme eines typischen C. albicans Biofilm visualisiert mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie. Bars sind 100 um und 10 um für Platten A und B jeweils.
Abbildung 2. Die Bildung von mehreren gleichwertigen C. albicans Biofilmen in 96-well Mikrotiterplatten. Colorimetric Lesungen (OD 490 Werte) aus XTT-Assays Reduzierung von Biofilmen durch eine C gebildet albicans-Wildtyp in Vertiefungen von Mikrotiterplatten. Die Werte sind für 11 unabhängige Biofilmen in jedem der 8 verschiedenen Zeilen der gleichen 96-well Mikrotiterplatte gebildet. Ergebnisse für die verschiedenen Zeilen von one-way Varianzanalyse und mit dem Bartlett-Test auf Homogenität der Varianzen und die Bonferroni-multiple Vergleich post-Test verglichen. Keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt wurden beim Vergleich aller Paare von Zeilen einander (P> 0,05).
Abbildung 3. Typische Ergebnisse von Antimykotika Empfindlichkeitsprüfung gegen C. albicans Biofilmen. Graph typische Ergebnisse der Wirksamkeit verschiedener Amphotericin B-Konzentrationen gegen Biofilme aus einem C albicans Wildtyp-Stamm. Die Werte sind als durchschnittliche prozentuale farbmetrischen Messwerte für XTT-Assays Reduzierung im Vergleich zum Brunnen Kontrolle ausgedrückt. SMIC50 und SMIC80 Werte sind durch Pfeile angedeutet.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine einfache, schnelle, kostengünstige und hoch reproduzierbare 96-well Mikrotiterplatte Modell für die Bildung von Candida Biofilmen mit einer kolorimetrischen Methode, die die Stoffwechselaktivität der Zellen Maßnahmen innerhalb des Biofilms mit XTT gekoppelt. Diese 96-well Mikrotiterplatte Modell für die Bildung von Biofilmen wurde ursprünglich für C entwickelt albicans, aber auch für andere Candida spp verwendet werden. und einfach für andere pilzliche Organismen angepasst. Die Methode kann verwendet werden, um mehrere Parameter und Einflussfaktoren auf die Bildung von Biofilmen zu untersuchen und die Biofilm-bildenden Fähigkeit von mehreren Pilzisolate und / oder Mutanten zu schätzen. Aber vielleicht am wichtigsten ist, ist diese Methode sehr nützlich für die Bestimmung der antimykotischen Empfindlichkeitstestung von Zellen in Biofilmen.
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Disclosures
JLL-R besitzt Aktien in MicrobeHTS Technologies, Inc., die Entwicklung von Antimykotika ist. MicrobeHTS Technologies, Inc. keine finanzielle Unterstützung für diese Studien.
Acknowledgments
Biofilm-bezogenen Arbeit im Labor wird durch Zuschüsse finanziert nummeriert R21DE017294 und R21AI080930 vom National Institute of Dental & Craniofacial Forschung und dem Nationalen Institut für Allergien und Infektionskrankheiten (zum JLL-R.). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der NIDCR, die NIAID oder die NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud-dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | To buffer RPMI 1640 |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Buffer for washes |
| XTT sodium salt | Sigma-Aldrich | X4251 | See above for preparation instructions |
| Ringer’s lactate | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution |
| Menadione | Sigma-Aldrich | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | |
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | ||
| Incubator | Any Supplier | ||
| Microtiter plate reader | Any Supplier |
References
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
- Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L.
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
- Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).
