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Immunology and Infection

स्पष्ट और इमेजिंग कैंडिडा एल्बिकान बायोफिल्म्स

Published: March 6, 2020 doi: 10.3791/60718
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, 2Department of Pharmacology, Second Military Medical University

Summary

कैंडिडा एल्बिकान बायोफिल्म्स की आंतरिक विशेषताओं को देखने और निर्धारित करने के लिए, हम निश्चित अक्षुण्ण नमूने तैयार करते हैं जिन्हें अपवर्तक सूचकांक मिलान द्वारा स्पष्ट किया जाता है। फिर, ऑप्टिकल सेक्शनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग बायोफिल्म की पूर्ण मोटाई के बावजूद त्रि-आयामी छवि डेटा प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

माइक्रोबियल कवक कैंडिडा एल्बिकान कॉममेंसल उपनिवेशीकरण से उग्रता में परिवर्तन से गुजर सकता है जो खमीर-रूप विकास से हाइहाल विकास में स्विच करने की क्षमता के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध है। इस प्रक्रिया को शुरू करने वाली कोशिकाएं एक बायोफिल्म कॉलोनी के परिणामस्वरूप विकास के साथ सतहों के साथ-साथ एक दूसरे के अनुयायी बन जाती हैं। यह आमतौर पर खमीर संक्रमण में म्यूकोसल ऊतक सतहों पर ही नहीं होता है, बल्कि कैथेटर जैसे चिकित्सा प्रत्यारोपण पर भी होता है। यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि बायोफिल्म कोशिकाएं एंटीफंगल दवाओं के लिए प्रतिरोधी हैं, और बायोफिल्म से शेड करने वाली कोशिकाएं खतरनाक प्रणालीगत संक्रमण का कारण बन सकती हैं। बायोफिल्म्स अपवर्तक विषमता के कारण भारी पारदर्शी से अपारदर्शी तक होते हैं। इसलिए फंगल बायोफिल्म्स को ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी से पढ़ाई करना मुश्किल होता है। आंतरिक संरचनात्मक, सेलुलर और उप-सेलुलर सुविधाओं की कल्पना करने के लिए, हम स्टेपवाइज सॉल्वेंट एक्सचेंज द्वारा इष्टतम अपवर्तक सूचकांक मिलान के बिंदु पर निश्चित अक्षुण्ण बायोफिल्मों को स्पष्ट करते हैं। सी एल्बिकान बायोफिल्म्स के लिए, मिथाइल सालिसिलेट (एन = 1.537) के साथ पर्याप्त स्पष्टीकरण प्राप्त किया जाता है ताकि कम क्षीणन के साथ 600 माइक्रोन बायोफिल्म्स में शीर्ष से आधार तक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सक्षम हो सके। इस दृश्य प्रोटोकॉल में हम चरण विपरीत रेफ्राक्टोमेट्री, प्रयोगशाला बायोफिल्म्स के विकास, निर्धारण, धुंधला, विलायक विनिमय, कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए सेटअप और प्रतिनिधि परिणामों की रूपरेखा तैयार करते हैं।

Introduction

कैंडिडा एल्बिकान एक माइक्रोबियल फंगस है जो आमतौर पर मनुष्यों में कॉममेंसल होता है। यह जीव विज्ञानियों के लिए मौलिक हित का है क्योंकि जीव में कई मॉर्मोलोजी हैं। उदाहरण के लिए, कुछ पर्यावरणीय संकेतों या तनावों के जवाब में, खमीर-रूप नवोदित कोशिकाएं हाइफे के रूप में जानी जाने वाली अत्यधिक लम्बी कोशिकाओं की सेप्टिंग श्रृंखला के रूप में तंतु विकास के लिए स्विच करेंगी। संक्रमण एक एककोशिकीय और बहुकोशिकीय जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम के बीच बदलाव की फेनोटाइपिक अभिव्यक्ति के उदाहरण के रूप में महत्वपूर्ण है। इसी तरह, सी एल्बिकान जैव चिकित्सा हित का है क्योंकि जीव एक प्रसिद्ध अवसरवादी रोगजनक है। यह चिड़िया (मौखिक कैंडीडियासिस), जेनिटोरिनरी संक्रमण, और इम्यूनोलॉजिकल रूप से कमजोर रोगियों में खतरनाक आक्रामक या प्रणालीगत संक्रमण के कारण जैसे म्यूकोसल खमीर संक्रमणों के लिए जिम्मेदार है।

इस जीव की उग्रता की क्षमता इसके कई रूपों और इसकी आनुवंशिक बहुमुखी प्रतिभाकेअन्य पहलुओं से निकटता से जुड़ी हुई है 1 ,2,3,4। रोगाणु ट्यूब विस्तार, हाइफाल विकास के लिए संक्रमण का पहला दृश्यमान चरण, पर्याप्त तेजी के साथ होता है ताकि सी एल्बिकान कोशिकाओं को फागोसाइट्स से बाहर निकल ने में सक्षम किया जा सके और इस तरह मेजबान5की सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रारंभिक चरण से बच सकें। इसके अतिरिक्त, फिलामेंटेशन पहले और सेल-टू-सेल और सेल-टू-सतह पालन में बड़ी वृद्धि के साथ होता है जो कोशिका दीवार प्रोटीन के कई वर्गों की विनियमित अभिव्यक्ति के कारण होता है जिसे चिपकनेवाला 6,7,8,9के रूप में जाना जाता है। विभिन्न प्रकार की स्थितियों के तहत, पालन और तंतंतु के संयोजन के परिणामस्वरूप प्लैंकटोनिक, एककोशिकीय विकास से सतह से जुड़े औपनिवेशिक विकास में नाटकीय बदलाव होता है जो बायोफिल्म बनाता है। सी एल्बिकान बायोफिल्म्स वेनुस कैथेटर जैसे सामान्य प्रत्यारोपित चिकित्सा उपकरणों पर विकसित हो सकती है। प्रसारित संक्रमण का परिणाम तब हो सकता है जब ऐसी बायोफिल्म्स खमीर-रूप कोशिकाओं को दूर करना शुरू कर देती हैं और उन्हें रक्त परिसंचारी में बहाती हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि बायोफिल्म कोशिकाएं प्लैंकटोनिक कोशिकाओं10,11की तुलना में एंटीफंगल दवाओं के लिए अधिक प्रतिरोधी होती हैं , जो मेटाबोलिज्म12को कम करने के कारण हो सकती हैं । इसके अलावा, एक बायोफिल्म का उच्च समग्र पालन मेजबान ऊतक1में हाइफे के कुशल आक्रामक विकास के लिए आवश्यक एंकरिंग प्रदान कर सकता है।

अपवर्तक सूचकांक मिलान द्वारा सी एल्बिकान बायोफिल्म्स के ऑप्टिकल स्पष्टीकरण का इस माइक्रोबियल समुदाय की संरचना की कल्पना करने और जीन अभिव्यक्ति और फेनोटाइप के बीच संबंधों की खोज करने की हमारी क्षमता पर एक बड़ा प्रभाव पड़ा है। 48 घंटे के लिए तरल संस्कृति माध्यम के तहत परीक्षण सतहों पर प्रयोगशाला में उगाई जाने वाली बायोफिल्म्स एक सफ़ेद कोटिंग के रूप में दिखाई देती है जो काफी घना है और अपारदर्शी होने के लिए पर्याप्त मोटी है(चित्रा 1)। इसलिए बायोफिल्म की कई दिलचस्प फेनोटाइपिक विशेषताएं देखने से छिपी हुई हैं। वाईपीडी, आरपीएमआई-1640 या स्पाइडर मीडियम में 37 डिग्री सेल्सियस तक उगाई जाने वाली 24 घंटे की वाइल्ड टाइप बायोफिल्म्स 300 माइक्रोन मोटी तक होती हैं, जिसमें 48 घंटे बायोफिल्म्स अक्सर 500 माइक्रोन तक पहुंच जाती हैं। अस्पष्टता प्रकाश बिखरने के कारण होती है, जो अपवर्तक विषमता से उत्पन्न होती है: फंगल सेल दीवार आसपास के माध्यम की तुलना में अधिक अपवर्तक होती है, और साइटोप्लाज्म सेल की दीवार की तुलना में थोड़ा अधिक अपवर्तक होता है। एक देशी बायोफिल्म का परिणामस्वरूप उच्च ऑप्टिकल घनत्व सभी संरचनाओं को 30 माइक्रोन से अधिक गहरा करता है जब पारंपरिक माइक्रोस्कोप या यहां तक कि कॉन्फोकल स्कैनर(चित्रा 2)के साथ देखा जाता है। हालांकि, एक उच्च अपवर्तक सूचकांक तरल के साथ निश्चित बायोफिल्मों में घुसपैठ करके बड़ी मात्रा में स्पष्टीकरण प्राप्त किया जा सकता है जो लगभग प्रमुख सेलुलर घटकों की अपवर्ढनता से मेल खाता है। स्पष्टीकरण के बाद, सबमाइक्रोन रिज़ॉल्यूशन पर इमेजिंग लगभग किसी भी सी एल्बिकान बायोफिल्म13की पूरी मोटाई के माध्यम से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा की जा सकती है। जंगली प्रकार के नमूनों में, यह देखना आसान है कि बायोफिल्मों में लंबे समय से उलझी हुई हाइफे, नवोदित खमीर-रूप कोशिकाओं या छद्म प्रचार कोशिकाओं, शून्य रिक्त स्थान और कुछ मात्रा में बाह्य मैट्रिक्स के समूह शामिल हैं। इसके अलावा, बायोफिल्म्स आम तौर पर स्तरीकृत होते हैं, सेल प्रकार, सेल घनत्व, और नवोदित या शाखाओं में बंटी कोशिकाओं की उपस्थिति में स्थानिक रूप से संस्करण रूपात्मक अंतर दिखाते हैं। इनमें से एक या अधिक विशेषताओं में कई भिन्नताएं14,15उत्परिवर्ती उपभेदों द्वारा विकसित बायोफिल्मों में देखी गई हैं । इसके अतिरिक्त, रिपोर्टर उपभेदों जीन अभिव्यक्ति16,9,13में सीटू स्थानिक मतभेदों में दिखा । इस अपेक्षाकृत सरल और सस्ती दृष्टिकोण के साथ प्राप्य स्पष्टीकरण की आश्चर्यजनक डिग्री भी यह देखना संभव बनाती है कि कई बायोफिल्मों में एपिकल हाइफे और बेसल इनवेसिव हाइफे शामिल हैं जो मिलीमीटर दूरी तक विस्तारित होते हैं।

इस दृश्य प्रोटोकॉल में, हम एक दाग के रूप में एक साधारण सेल वॉल मार्कर का उपयोग करके सी एल्बिकान बायोफिल्म के फिक्सिंग, लेबलिंग, स्पष्टीकरण और इमेजिंग को प्रदर्शित करते हैं। प्रोटोकॉल के वर्तमान संस्करण की उत्पत्ति बेहतर स्पष्टता है जिसे हमने देखा जब फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड बायोफिल्म्स को 97% ग्लाइकोल मेथेक्रिलेट (जीएमए) के साथ घुसपैठ की गई थी, जिसे तब एक कठोर प्लास्टिक में बायोफिल्म को एम्बेड करने के लिए बहुलीकृत किया गया था जिसमें मामूली उच्च अपवर्तक सूचकांक (एन = 1.49)। इसके बाद हमने बायोफिल्म(चित्रा 3)के कंट्रास्ट रिवर्सल (अधिकतम पारदर्शिता) के बिंदु को अधिक सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए पारंपरिक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी और अपवर्तक सूचकांक संदर्भ तरल पदार्थकी की एक श्रृंखला का उपयोग किया। सी एल्बिकान बायोफिल्म्स के लिए यह एन = 1.530 के करीब हुआ, जो आश्चर्यजनक रूप से उच्च था कि बालों केराटिन जैसी एक सघन प्रोटीन संरचना केवल थोड़ी अधिक अपवर्तक (1.54-1.55) है। हालांकि यह चित्रा 3में इष्टतम रेंज के ऊपरी छोर पर है, हम मिथाइल सालिसिलेट (wintergreen के तेल, n = १.५३७) वर्तमान प्रोटोकॉल में अपनाया क्योंकि यह लंबे समय से भ्रूण विज्ञान और हिस्टोलॉजी में माइक्रोस्कोपी के लिए एक स्पष्ट एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया है, यह कम विषाक्तता और कम वाष्प दबाव है, और यह हमारे परीक्षणों में मध्यम-एनए तेल विसर्जन प्रकाशिकी का उपयोग कर उत्कृष्ट परिणाम दिया ।

यहां चार अंक बनाए जाने चाहिए:

(1) कुछ अपवादों के साथ, माइक्रोस्कोपी में आदर्श स्थिति यह है कि नमूने का अपवर्तक सूचकांक उद्देश्य लेंस विसर्जन द्रव17,18,13के अपवर्तक सूचकांक के बराबर होना चाहिए । त्रि-आयामी (3 डी) इमेजिंग अध्ययन के लिए जहां गहरी ध्यान केंद्रित करना आवश्यक है, यह हमेशा महत्वपूर्ण होता है।

(2) इष्टतम समाशोधन के लिए हमारा प्रायोगिक परिणाम (एन = 1.525-1.535) मानक विसर्जन तेलों (एन = 1.515, 1.518) की तुलना में थोड़ा अधिक है और इसलिए बिंदु (1) का उल्लंघन करता है, और इस प्रकार मानक तेल विसर्जन प्रकाशिकी का उपयोग करते समय गोलाकार विचलन का एक स्रोत पेश करता है। इस समस्या का एक समाधान उच्च सीमा में विसर्जन सूचकांक के लिए डिज़ाइन किए गए उद्देश्य का उपयोग है। इमेजिंग में रुचि के पुनरुत्थान के कारण नमूनों को मंजूरी दे दी, आवश्यक सुधार के साथ विशेषता उद्देश्य उपलब्ध होते जा रहे हैं । अन्य समाधान इष्टतम तेल विसर्जन प्रदर्शन के लिए ब्यूटानोल (एन = 1.399) की एक छोटी राशि के अलावा स्पष्ट माध्यम के सूचकांक को 1.515 या 1.518 तक समायोजित करना है, और थोड़ा अवक्रमित स्पष्टता स्वीकार करना है।

(3) बरकरार बायोफिल्म्स (और इस पैमाने पर अन्य नमूनों) की माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना मोटाई को समायोजित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कार्य दूरी की आवश्यकता होती है। यह एक प्रमुख व्यावहारिक विचार है । एक लंबी कार्य दूरी प्रकाशिकी को मध्यम संख्यात्मक एपर्चर (एनए = 0.6-1.25) तक सीमित करती है, जो संकल्प को सीमित करती है लेकिन गोलाकार विचलन की गंभीरता को भी सीमित करती है।

(4) स्पष्टीकरण के लिए इष्टतम अपवर्तक सूचकांक अन्य प्रकार के निश्चित नमूनों के लिए अलग हो सकता है। नमूनों का परीक्षण तदनुसार चरण विपरीत और अपवर्तक सूचकांक संदर्भ तरल पदार्थों की एक श्रृंखला का उपयोग करके किया जाना चाहिए जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है ।

Protocol

1. बायोफिल्म संस्कृतियों का विकास

सावधानी: कैंडिडा एल्बिकान एक मानव रोगजनक है। कुछ संस्थानों में इस जीव की संस्कृति के लिए बीएसएल-2 रोकथाम की आवश्यकता होती है।

  1. खमीर निकालने-पेप्टोन-डेक्सट्रोस (वाईपीडी) एगर प्लेट पर चयनित तनाव को बाहर निकालें और 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे बढ़ें।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एरोबिक विकास (हिंडोला रोटेटर, 52-55 आरपीएम) के लिए 15 मिलीएल संस्कृति ट्यूबों में वाईपीडी माध्यम के 5 मिलील का टीका लगाने के लिए प्लेट से एकल उपनिवेशों का चयन करें।
  3. रात भर की संस्कृति के 40 से 50 गुना कमजोर पड़ने का उपयोग करके सेल घनत्व निर्धारित करें। सिलिकॉन सबस्ट्रैटा के लिए सेल घनत्व को 3 x 106 सेल/mL में लाने के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने वाले कारक की गणना करें, या 0.6-1.2 x 106 कोशिकाओं/mL कवर ग्लास सतहों के लिए concanavalin-A (कोना) या गेहूं-रोगाणु agglutininin (WGA) (देखें चर्चा) के साथ इलाज किया ।
  4. 12 अच्छी प्लेट(चित्रा 1)में बायोफिल्म वृद्धि के लिए, प्रत्येक कुएं में बाँझ तंतु के 2.0 mL को वितरित करें, और प्लेट को आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। मीडिया की एक किस्म तंतुओं को प्रेरित करेगी, एक ऊंचा तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) पर और अतिरिक्त सीरम के साथ अधिक दृढ़ता से। भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) की सिफारिश की जाती है। अनुशंसित मीडिया वाईपीडी, स्पाइडर-मैनिटॉल, या आरपीएमआई-1640 हैं।
  5. बाँझ चिमटी के साथ, गर्म थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से एक तैयार सबस्ट्रेटम रखें और बुलबुले को उखाड़ फेंकें। प्रत्येक कुएं में चरण 1.3 में अनुशंसित सेल घनत्व तक पहुंचने के लिए रातोंरात संस्कृति से इनोकुलम जोड़ें। इनोकुलम के बिना एक अच्छी तरह से संदूषण के खिलाफ एक दृश्य खाली और नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
  6. कोशिका आसंजन के लिए समय की अनुमति देने के लिए 90 मीटर की दूरी पर एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस एयर इनक्यूबेटर में प्लेट को 60 आरपीएम ऑर्बिटल मिक्सर पर रखें। 90 न्यूनतम के बाद, मध्यम और असंबद्ध कोशिकाओं को हटा दें, बाँझ माध्यम या फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) से धोएं, और टीका लगाने वाले सबस्ट्रैटा को संस्कृति व्यंजनों या किसी अन्य मल्टीवेल प्लेट में रखें जिसमें प्रीवार्म्ड फिलामेंशन मीडियम हो। मल्टीवेल प्लेटों के साथ, धोए गए अकूत उपस्तर प्राप्त करने के लिए प्रति अच्छी तरह से 2.0 मिलील प्रीवार्मेड मध्यम के साथ वॉश स्टेप और तीसरी प्लेट के लिए दूसरी प्लेट का उपयोग करना बहुत सुविधाजनक है। प्रत्येक हस्तांतरण से पहले चिमटी स्टर्लिज़ाइज करें।
  7. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस आर्द्र परिवेश-वायु इनक्यूबेटर पर लौटाएं और बायोफिल्म्स को 48 घंटे तक बढ़ाएं जिसमें 60 आरपीएम कक्षीय मिश्रण के साथ वातारण के लिए। प्रत्येक संस्कृति में थोड़ा प्लवक विकास होना चाहिए जब तक कि विकासशील बायोफिल्म खमीर-रूप कोशिकाओं को बहा न दे। इस तरह से उगाई गई एक बायोफिल्म को फिगर 1में दिखाया गया है ।

2. इमेजिंग के लिए नमूना प्रसंस्करण

सावधानी: एल्डिहाइड फिक्सेटिव अस्थिर और खतरनाक होते हैं। एक धुएं हुड में फिक्सिव कमजोरहोन तैयार करें, एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में नहीं। लाइव कोशिकाओं के लिए उपयोग किए जाने वाले इनक्यूबेटर में फिक्सेटिव न डालें। एक धुएं हुड या एक अच्छी तरह से हवादार बेंचटॉप क्षेत्र में कवर व्यंजनों में पतला फिक्सवेटिव के साथ काम करते हैं। फिक्सेटिव और पोस्ट-फिक्स वॉश समाधानों को खतरनाक कचरे के रूप में निपटाएं।

  1. पीबीएस में ताजा फिक्सेटिव, 4% फॉर्मलडिहाइड या पैराफॉर्मलडिहाइड तैयार करें, वैकल्पिक रूप से 2% ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ। फॉर्मेलिन का उपयोग नियमित कार्य के लिए 4% तक किया जा सकता है।
    नोट: विशेष रूप से ग्लूटाराल्डिहाइड से ब्रॉडबैंड ऑटोफ्लोरेसेंस बढ़ेगा और यह dTomato जैसे व्यक्तीय टैग के फ्लोरेसेंस को क्षीण कर सकता है।
  2. नमूना से संस्कृति माध्यम निकालें और सीरम प्रोटीन को कम करने के लिए पीबीएस के साथ बदलें, या कई मिनटों के लिए अपने उपस्तर पर बायोफिल्म को पीबीएस में स्थानांतरित करें।
  3. नमूने को फिक्सेटिव में स्थानांतरित करें, और कवर किए गए पकवान को 20 मीटर के लिए धीमी कक्षीय मिक्सर पर सेट करें। मोटा नमूनों को संसाधित करते समय समय अवधि बढ़ाएं (चर्चा देखें)। पकवान के भीतरी किनारों पर किसी भी सहित सभी बायोफिल्म विकास को विसर्जित करने के लिए प्रत्येक डिश में पर्याप्त फिक्सिव वॉल्यूम जोड़ा जाना चाहिए।
  4. पुनर्वर्तक को हटा दें और अवशिष्ट फिक्सेटिव को धोने के लिए पीबीएस के साथ पकवान को फिर से भरें। फिक्सेटिव को खतरनाक कचरे के रूप में निपटाएं। कई अल्पकालिक वॉश दोहराएं, फिर अवशिष्ट फिक्से के लिए बायोफिल्म या एगर ब्लॉक से बाहर निकलने के लिए समय की अनुमति देने के लिए लंबे समय तक धोता है। वॉश पीरियड निर्धारण के लिए अनुमति दिए गए समय पर निर्भर करता है (चर्चादेखें)।
  5. दाग की जरूरत मात्रा बायोफिल्म द्रव्यमान पर निर्भर करेगी। धुंधला करने से पहले संस्कृति पकवान के गैर नमूना क्षेत्रों से सभी बायोफिल्म निकालें, या धुंधला के आगे एक नई डिश में तय नमूना हस्तांतरण । बायोफिल्म को नाली या सूखने न दें।  इसे पीबीएस में डुबोकर रखें।
  6. पकवान के लिए दाग जोड़ें (चर्चा देखें) और एक धीमी कक्षीय मिक्सर पर कवर पकवान रात भर सेट (चर्चा देखें) । प्रकाश से रक्षा करें।
  7. सुबह में, धुंधला समाधान निकालें और अनबाउंड दाग को पतला करने के लिए पीबीएस के साथ पकवान को फिर से भरना। कई घंटों के लिए destain करने के लिए धीमी गति से कक्षीय मिक्सर पर व्यंजन सेट करें।

3. स्पष्टीकरण प्रोटोकॉल: इम्परमतलब सबस्ट्रैटा पर बायोफिल्म्स

  1. स्पष्ट बायोफिल्म्स नेत्रहीन विचार करने के लिए कठिन हैं । इसलिए, यदि वांछित हो, तो टीका के लिए पक्ष को नामित करने के लिए प्रत्येक उपस्तर के एक तरफ को खरोंच के साथ चिह्नित करें।
  2. सॉल्वैंट्स के क्रॉस संदूषण से बचने के लिए बाद के सभी अपशिष्ट और विलायक स्थानान्तरण के लिए लेबल वाले लंबे पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
  3. चिमटी का उपयोग करना, PBS से 50:50 PBS के 5 mL के लिए निश्चित बायोफिल्म स्थानांतरित: बायोफिल्म का सामना करना पड़ के साथ एक 20 मीटर ग्लास शीशी में मेथनॉल । मैन्युअल रूप से 5 मिन के लिए 1 मिन अंतराल पर कक्षीय गति के साथ मिश्रण (चर्चा देखें) ।
  4. एक बेकार बोतल के लिए विलायक निकालें, पिपेट और बायोफिल्म, या बायोफिल्म और शीशी के बीच संपर्क से बचने के लिए सतर्क किया जा रहा है । धीरे-धीरे साफ मेथनॉल के 3 एमएल के साथ फिर से भरना। मैन्युअल रूप से 3 मिन के लिए 1 मिन अंतराल पर कक्षीय गति के साथ मिश्रण।
  5. सॉल्वेंट को बेकार की बोतल में निकालें, और तुरंत मेथनॉल के 5 mL से रिफिल करें। मैन्युअल रूप से 5-10 0 00 के लिए 1 मिन अंतराल पर कक्षीय गति के साथ मिलाएं। बेकार की बोतल में सॉल्वेंट को हटा दें, और तुरंत मेथनॉल के 3 मिलील के साथ फिर से भरें। बायोफिल्म्स अक्सर अपनी शुरुआती उपस्थिति की तुलना में इस बिंदु पर अधिक अपारदर्शी दिखते हैं।
  6. बेकार बोतल के लिए विलायक निकालें, और तुरंत 50:50 मेथनॉल के 5 mL के साथ शीशी को फिर से भरना: मिथाइल सालिसिलेट। मैन्युअल रूप से 5-10 0 0 0 00 के लिए 1 मिन अंतराल पर कक्षीय गति के साथ मिश्रण करें। इस मिश्रित सॉल्वेंट में बायोफिल्म को अर्धपारदर्शी होना चाहिए।
  7. सॉल्वेंट को बेकार की बोतल में निकाल लें। धीरे साफ मिथाइल सालिसिलेट (एमएस) के 3 एमएल के साथ शीशी को फिर से भरना। मैन्युअल रूप से 3 मिन के लिए 1 मिन अंतराल पर कक्षीय गति के साथ मिश्रण।
  8. बेकार बोतल के लिए विलायक निकालें, और तुरंत साफ एमएस के 5 एमएल के साथ फिर से भरना । मैन्युअल रूप से 5-10 min के लिए 1 मिन अंतराल पर कक्षीय गति के साथ मिश्रण । इस बिंदु पर, बायोफिल्म पारदर्शी होना चाहिए। बेकार बोतल के लिए विलायक निकालें, और तुरंत साफ एमएस के 3 एमएल के साथ शीशी फिर से भरना । प्रोसेस्ड बायोफिल्म इस सॉल्वेंट में स्थिर है।
  9. आगर पर बायोफिल्म्स के लिए (चर्चा देखें) आगर के पानी और सॉल्व डिफ्यूजन के लिए अनुमति देने के लिए सभी एक्सचेंज टाइम पीरियड का विस्तार करें। आवश्यक समय अवधि आगर में विलायक अग्रिम देखने के लिए डार्कफील्ड रोशनी के साथ एक कम शक्ति विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है । प्रोटोकॉल अच्छा स्पष्टीकरण प्राप्त करता है और कोई बड़ा सिकुड़न प्रभाव जब 2% आगर का उपयोग किया जाता है, लेकिन स्पष्ट आगर अगर चिमटी के साथ हैंडलिंग निचोड़ा संघनित होगा । स्पैटुला के उपयोग की सिफारिश की जाती है।

4. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए इमेजिंग सेटअप

  1. निम्नलिखित कदम उल्टे माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए हैं। एक विलायक प्रूफ डिश का उपयोग करें जिसमें माइक्रोस्कोप चरण पर उल्टे नमूने को पकड़ने के लिए एक कवर ग्लास बॉटम हो (चर्चा देखें)।
  2. उल्टे नमूने के समर्थन के लिए स्पेसर तैयार करें। माइक्रोस्कोप स्लाइड (1,000 माइक्रोन मोटी), कवर चश्मा (170 माइक्रोन), या 13 मिमी सिलिकॉन के छल्ले (330 माइक्रोन, सामग्री की तालिकादेखें), जो जरूरत के रूप में खड़ी हो सकती है से कटौती छोटे आयतों का उपयोग करें। सूजन के कारण फोकस बहाव को कम करने के लिए 1 घंटे के लिए मिथाइल सालिसिलेट में छल्ले को प्रीभिगो करें।
  3. एक चिकित्सा ग्रेड सिलिकॉन स्क्वायर पर एक बायोफिल्म के लिए, वर्ग उलटा (यानी, यह बायोफिल्म नीचे बारी) और यह पकवान में मिथाइल सालिसिलेट के एक पूल में एक स्पेसर पर सेट(चित्रा 2)। नमूने के नीचे किसी भी बुलबुले से बचने के लिए सुनिश्चित करें।
  4. माइक्रोस्कोप के मंच पर पकवान को मजबूती से माउंट करें और उद्देश्य के साथ तेल को डूबे हुए संपर्क बनाएं (चर्चा देखें)।
  5. डिश में एमएस की मात्रा को समायोजित करें ताकि मेनिसकस सतह तनाव से स्पेसर पर नमूने को मजबूती से नीचे रख सके। मैट फिनिश से प्रकाश तितर-बितर को कम करने के लिए उल्टे स्क्वायर सबस्ट्रेटम के शीर्ष पर एमएस की एक बूंद रखें, और वाष्पीकरण को सीमित करने के लिए एक ग्लास प्लेट के साथ पकवान को कवर करें। इमेजिंग से पहले स्पेसर्स पर बसने के लिए नमूने के लिए कई मिनट इंतजार करें।
  6. दृश्य के क्षेत्र का नेत्रहीन निरीक्षण करने और उल्टे बायोफिल्म के एपिकल और बेसल क्षेत्रों के सापेक्ष वर्तमान फोकस स्थिति का पता लगाने के लिए प्रेषित प्रकाश का उपयोग करें। इसके विपरीत बढ़ाने के लिए कंडेनसर रोशन संख्यात्मक अपर्चर (आईएए) को न्यूनतम (कंडेनसर आईरिस को बंद करना) सेट करें, अन्यथा स्पष्ट बायोफिल्म लगभग अदृश्य होगी। जब किया जाता है, तो प्रेषित प्रकाश स्रोत को बंद कर दें।
  7. कंफोकल फ्लोरेसेंस पर स्विच करें और बायोफिल्म को फैलाने के लिए आवश्यक धारावाहिक-फोकस छवि ढेर की निचली और ऊपरी सीमाएं निर्धारित करें। ऊपर की ओर फोकस ड्राइव कदम, जो सिफारिश की है, पहले उखाड़ दिया कोशिकाओं है कि कवर ग्लास और बहुत लंबे समय तक apical हाइफे कि गिलास पर आराम कर रहे है पर बसे है दिखाएगा । अनुक्रम के ऊपरी छोर पर, संस्थापक कोशिकाओं को बायोफिल्म के आधार पर उपस्तर का पालन करते हुए देखा जाना चाहिए। पिनहोल व्यास सेट करें, छवि विमान में पिक्सेल अंतर, और चर्चा में उल्लिखित सामान्य मानदंडों का उपयोग करके फोकस चरण वृद्धि।

Representative Results

इस तरह के रूप में बायोफिल्म्स कि चित्रा 1 में भारी अपारदर्शी करने के लिए पारदर्शी हैं, लेकिन नियमित रूप से स्पष्ट कर रहे है और ऊपर प्रोटोकॉल को रोजगार द्वारा छवि । चित्रा 2 इंडेक्स मिलान के बाद एक निश्चित बायोफिल्म की तुलना में पीबीएस में एक निश्चित बायोफिल्म में फोकस गहराई के साथ फ्लोरेसेंस के मजबूत क्षीणता को दर्शाता है। जैसा कि चित्रा 3में दिखाया गया है, अपवर्तक सूचकांक में वृद्धि के क्रमिक रूप से गलत सॉल्वैंट्स का उपयोग करके स्पष्टता में अधिकतम का अनुमान लगाया जा सकता है। यह न्यूनतम विपरीत (अधिकतम पारदर्शिता) के बिंदु को खोजने के लिए पारंपरिक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा परिष्कृत किया जाता है। यह स्पष्ट है कि यह इष्टतम सजातीय सूचकांक मिलान द्वारा प्राप्त नहीं किया जाता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि उपकोशिकीय संरचनाएं अपवर्तक सूचकांक में थोड़ी भिन्न होती हैं। इस मामले में, कंट्रास्ट रिवर्सल साइटोप्लाज्म की तुलना में थोड़ा कम सॉल्वेंट इंडेक्स में सेल वॉल में हुआ। कैंडिडा एल्बिकान बायोफिल्म्स के लिए, इष्टतम एन = 1.530 के करीब होता है। 48 एच जंगली प्रकार और Cak1 DX म्यूटेंट बायोफिल्म्स फिगर 4ए में मोटाई में 500 माइक्रोन थे, फिर भी आधार पर खमीर कोशिकाओं को लगभग उतनी ही तेजी से चित्रित किया गया था जितना कि एपिकल कोशिकाओं के रूप में। इसी तरह, जैसा कि चित्र4 Cमें दिखाया गया है, फ्लोरेसेंस का क्षीणन ध्यान गहराई के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध नहीं था। चित्रा 5 आगर में आक्रामक हाइफे दिखाता है, एक सतह बायोफिल्म के नीचे सैकड़ों माइक्रोमीटर। परिपक्व आक्रामक हाइफे लगातार हाइफाल श्रृंखला में सेप्टा के लिए पार्श्व नवोदित खमीर समीपस्थ का उत्पादन, एक आक्रामक हाइहा के साथ नियमित अंतराल पर खमीर की तरह कोशिकाओं के उपकालोनियों को जंम दे रही है ।

Figure 1
चित्रा 1: स्पष्टीकरण से पहले बायोफिल्म संस्कृतियों । एक 24 घंटे बायोफिल्म एक पूरित efg1 के एक अलग से हो गया () RPMI में एक सिलिकॉन स्क्वायर पर एक 12 अच्छी तरह से थाली में सी albicans के तनाव-१६४० तरल मध्यम 10% FBS के साथ पूरक । बाँझ खाली अच्छी तरह से C4 में है ।  इनसेट से पता चलता है कि एक ही माध्यम में आक्रामक हाइफे दिखा ते हुए एक ही माध्यम में 3.75 मिमी आगर बेस पर 6-अच्छी प्लेट में उगाई गई 96-घंटा वाइल्ड-टाइप बायोफिल्म के क्रॉस-सेक्शन में कटौती की गई है। दोनों पैनल एक ही पैमाने पर हैं । स्केल बार = 2.0 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सूचकांक मिलान द्वारा गहरी इमेजिंग में सुधार। यह आंकड़ा 48 घंटे जंगली प्रकार की बायोफिल्म से कॉन्फोकल छवि के ढेर के साइडव्यू अनुमानों को दर्शाता है जिसे कोना-एलेक्सफ्लोर 594 से ठीक और दाग दिया गया था। (क)नमूना पीबीएस में एक 63x 1.0 एनए प्रत्यक्ष जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर छवि थी । क्षीणन 30 μm की एक ध्यान गहराई में गंभीर था । (ख)प्रोटोकॉल चरण3.3-3.8 द्वारा स्पष्टीकरण के बाद, एक ही बायोफिल्म मिथाइल सालिसिलेट में 40x 0.85 एनए तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर न्यूनतम क्षीणन के साथ चित्रित किया गया था । 3 डी इमेज स्टैक के बैकग्राउंड घटाव और साइडव्यू प्रोजेक्शन के बाद, 40x डेटा को तुलना के लिए 63x डेटा से मेल खाने के लिए स्थानिक रूप से फिर से स्केल किया गया था। (ग)योजनाबद्ध आरेख एक सीमेंटेड कवर ग्लास बॉटम (चर्चा देखें) के साथ एक काले-एनोडाइज्ड एल्यूमीनियम डिश में एमएस को स्थानांतरित करके मंजूरी दे दी नमूने (एमएस से) के उल्टे बढ़ते दिखा रहा है । स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: चरण विपरीत रेफ्राक्टोमेट्री इष्टतम सूचकांक मिलान की सीमा में सेलुलर सुविधाओं के विपरीत उलट दिखाता है। कवर चश्मे पर फिक्स्ड बायोफिल्म्स को पीबीएस से मेथनॉल में एक्सचेंज किया गया था, फिर जाइलीन (एन = 1.496) में। इन बायोफिल्म्स को फिर जाइलीन से एक-एक अपवर्तक सूचकांक संदर्भ तरल पदार्थ (श्रृंखला ई, कारगिल प्रयोगशालाओं, सामग्री की तालिकादेखने) के एक सेट में बदला गया था और उच्चतम पारदर्शिता देने वाली सूचकांक सीमा निर्धारित करने के लिए दृष्टिसे साथ-साथ जांच की गई थी। (ऊपरी पैनल) चरण विपरीत छवियां: एक बायोफिल्म क्रमिक रूप से उस सीमा में जाइलीन और संदर्भ तरल पदार्थ के एक संकीर्ण सेट के बीच विमर्श किया गया था । प्रत्येक एक्सचेंज के बाद, एक ही क्षेत्र को दूसरी जगह और देखा गया था, हालांकि 40x 0.85 एनए Ph2 तेल विसर्जन चरण विपरीत उद्देश्य और Ph2 कंडेनसर का उपयोग करके एक कवर ग्लास। सभी छवियों को सही ढंग से प्रदर्शित परिवर्तन करने के लिए एक ही दीपक सेटिंग और कैमरा एक्सपोजर के साथ दर्ज किया गया था। सूचकांक बढ़ाने के साथ, कंट्रास्ट रिवर्सल को पहली बार सेल वॉल के लिए एन = 1.530 पर देखा जाता है, इसके बाद एन = 1.535 पर साइटोप्लाज्म होता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। (निचले पैनल) अधिकतम पारदर्शिता के बिंदु पर औसत बायोफिल्म चमक में न्यूनतम दिखा ग्राफ। बायोफिल्म के भीतर प्रकाश के मजबूत बिखरने से औसत चमक खाली क्षेत्र से अधिक हो जाती है। अलग कोशिकाओं को खाली क्षेत्र की तुलना में गहरा दिखाई देते हैं, सीमा 1.530-1.535 में विपरीत उलट करने के लिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार सी एल्बिकान बायोफिल्म्स की गहरी इमेजिंग। एक जंगली प्रकार तनाव (DAY185) और एक सेल चक्र से संबंधित प्रोटीन kinase कम अभिव्यक्ति तनाव(cak1 DX)14 तरल YPD माध्यम में सिलिकॉन उपस्तर पर ४८ घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया । बायोफिल्म्स तय किए गए थे, कोना-एलेक्साफ्लोर 594 से दाग दिए गए थे, और मिथाइल सालिसिलेट में सॉल्वेंट एक्सचेंज प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्पष्ट किया गया था। 3डी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी से पता चला कि दोनों बायोफिल्म्स ~ 500 माइक्रोन मोटी थीं। इमेज डेटा को इमेजजे या फिजी (https://imagej.nih.gov/ij/ या http://fiji.sc) में 32-बिट प्रारूप में परिवर्तित किया गया था, फिर 50-पिक्सेल रोलिंग बॉल त्रिज्या के साथ घटाई पृष्ठभूमि फ़ंक्शन का उपयोग करके संसाधित किया गया था, नकारात्मक पिक्सेल को शून्य पर सेट करने, टुकड़े करने और साइड व्यू का उत्पादन करने के लिए अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करने के लिए थ्रेसहोल्ड किया गया था। (A)अक्षीय और साइड-व्यू अनुमान: जंगली प्रकार की बायोफिल्म 558-प्लेन कॉन्फोकल इमेज स्टैक के साइड व्यू प्रोजेक्शन में देखी गई 502 माइक्रोन की मोटाई तक बढ़ी। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (बाएं हाथ के पैनल) एपेक्स (ऊपर) से बेस (नीचे) तक 40-प्लेन अक्षीय अनुमान बायोफिल्म के विभिन्न स्तरों में सेल प्रकारों में भिन्नता दिखाते हैं। इस उदाहरण ने विशेषता जंगली प्रकार की संरचना दिखाई: आधार पर अनुयायी कोशिकाएं हाइफे को जन्म देती हैं जो छद्म प्रचार और खमीर जैसी कोशिकाओं के घने मध्य क्षेत्र में चढ़ती हैं। मिडजोन के ऊपर, हाइफे फिर से उभरा और नवोदित खमीर के समूहों को जन्म दिया। लंबे समय से apical क्षेत्र में देखा हाइफे की संभावना जीवित बायोफिल्म में संस्कृति माध्यम में विस्तारित है, लेकिन नमूना प्रसंस्करण के दौरान बायोफिल्म की सतह पर मुड़ा । cak1 DX बायोफिल्म ५०० μm की मोटाई के रूप में ५५६ विमान छवि ढेर के साइड-व्यू प्रक्षेपण में देखा वृद्धि हुई । यह उत्परिवर्ती, जो तनाव को प्रेरित करने के अभाव में तंतरांत विकास से गुजरने के लिए जाना जाता है14,एक नाटकीय रूप से अलग वास्तुकला का उत्पादन किया। जैसा कि साइडव्यू और अक्षीय अनुमानों (दाएं हाथ के पैनलों) दोनों में देखा गया है, कई शाखाओं वाली कोशिकाओं ने रेडियल आउटग्रोथ को जन्म दिया। (ख) cak1 DX बायोफिल्म के भीतर हाइफे शाखाओं में बंटी के उदाहरण । स्केल बार = 10 माइक्रोन। (ग)स्पष्ट जंगली प्रकार बायोफिल्म में गहराई के साथ फ्लोरेसेंस क्षीणता पृष्ठभूमि पिक्सल बाहर मास्किंग द्वारा निर्धारित किया गया था, तो प्रत्येक छवि विमान में सभी गैर पृष्ठभूमि पिक्सल के लिए औसत डिजिटल संकेत कंप्यूटिंग । एपिकल हाइफे के अपवाद के साथ जिसे लेक्टिन द्वारा चमकीले टैग किया जाता है, फोकस गहराई के साथ कोई मजबूत क्षीणन प्रवृत्ति नहीं थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: आगर में इनवेसिव हाइफे। सी एल्बिकान हाइफे एक सतह बायोफिल्म में मिलीमीटर दूरी के लिए एक आगर सबस्ट्रेटम में प्रवेश करेगा (चित्रा 1देखें)। स्पष्टीकरण के बाद, आक्रामक संरचनाओं को नीचे की ओर देखा जा सकता है, हालांकि बायोफिल्म, या आगर के नीचे की ओर से ऊपर की ओर। बाद में अधिक से अधिक कार्य दूरी की मांग करता है । वैकल्पिक रूप से, निर्धारण के बाद, लेकिन धुंधला और विलायक विनिमय से पहले, आगर को स्केलपेल या रेजर ब्लेड के साथ 1-2 मिमी स्लैब में लंबवत काटा जा सकता है जिसे फिर एक तरफ मोड़ा जा सकता है और धुंधला और स्पष्टीकरण के बाद सीधे साइड व्यू में इमेज किया जा सकता है। इस प्रक्रिया की सिफारिश की जाती है। देखने के एक 213 μm वर्ग क्षेत्र के इस प्रक्षेपण में, एक इंद्रधनुष रंग पैमाने पर एक 75 μm रेंज पर अक्षीय स्थिति को एन्कोड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था: नीली सुविधाओं के पास हैं और लाल सुविधाओं पृष्ठ के विमान में गहरे हैं। इस दृश्य से पता चलता है कि अर्धनियमित अंतराल पर पार्श्व खमीर-रूप कोशिकाओं से लंबे हाइफे बड जो उपकालोनियों को जन्म देते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

ऑप्टिकल सेक्शनिंग, रिज़ॉल्यूशन, गति, परिहार या विपथन, मल्टीचैनल अधिग्रहण और कंप्यूटिंग शक्ति के मुआवजे में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी में प्रगति, इमेजिंग बरकरार नमूनों में पुनरुत्थान का कारण बना है। निश्चित नमूनों के लिए शास्त्रीय और उपन्यास स्पष्टीकरण और विस्तार दोनों तरीकों का बड़ा प्रभाव पड़ा है19,20,21,22,23,24। इस मामले में, हमने फंगल बायोफिल्म्स की संरचना का अध्ययन करने के लिए एक तेज और सरल विलायक आधारित सूचकांक मिलान दृष्टिकोण लागू किया जो अपारदर्शी के लिए भारी पारदर्शी हैं।

पूर्ववर्ती प्रोटोकॉल नमूनों की एक श्रृंखला के साथ परीक्षण किया गया है । हमारी प्रयोगशाला में कैंडिडा एल्बिकान बायोफिल्म्स अक्सर चिकित्सा ग्रेड सिलिकॉन रबर की शीट से काटे गए 14 मिमी वर्गों पर उगाई जाती हैं (सामग्री की तालिकादेखें)। इस उपस्तर का उपयोग इसलिए किया जाता है क्योंकि तरल संस्कृति माध्यम में डूबे पीडीएमएस (पॉली-डाइमेथिलसिलोक्सन) पर वृद्धि चिकित्सा प्रत्यारोपण, विशेष रूप से निवास कैथेटर से जुड़े संक्रमणों के लिए एक महत्वपूर्ण इन विट्रो मॉडल के रूप में स्थापित की गई है। तंतुओं की शुरुआत करने वाली बलित कोशिकाएं पीडीएफएम जैसी गैर-ध्रुवीय सतहों का जल्दी से पालन करती हैं। व्यवहार में, एक ऑटोक्लेव (शुष्क चक्र) में साफ और विश्राम किए गए वर्गों का उपयोग किया गया है, किसी विशेष तनाव के लिए सबसे सुसंगत बायोफिल्में देते हैं। बायोफिल्म्स को आमतौर पर कवर ग्लास ग्लास पर, कवर ग्लास बॉटम कल्चर व्यंजनों में, मानक जीवाणु ग्रेड पॉलीस्टीरिन व्यंजनों में और आगर पर उगाया जाता है। क्योंकि सी एल्बिकान कोशिकाएं ग्लास का अच्छी तरह से पालन नहीं करती हैं, कवर चश्मे को एक लेक्टिन के साथ इलाज किया जाना चाहिए जो सेल वॉल पॉलीसैकराइड्स को बांध देगा। हम प्रत्येक कवरस्लिप सतह पर बाँझ पानी में 1 मिलीग्राम/mL कोना या WGA के ४० μL लागू होते हैं । सूखने के बाद, कवर चश्मे को एक अघुलनशील फिल्म में प्रोटीन को क्रॉसलिंक करने के लिए 3 मिन के लिए 1% ग्लूटाराल्डिहाइड के 40 माइक्रोन के साथ इलाज किया जाता है। इसके बाद उन्हें फिक्सेटिव और किसी भी घुलनशील लेक्टिन और हवा में सूखे को हटाने के लिए बाँझ आसुत पानी से धोया जाता है । यदि आवश्यक हो, तो इलाज कवर चश्मा या व्यंजन 10 मिन के लिए एक जर्मिसिडल यूवी लैंप के नीचे रिरेट्रिल किया जाता है।

नमूना मोटाई प्रोटोकॉल में आवश्यक ऊष्मायन अवधि को प्रभावित करेगा। 300 माइक्रोन बायोफिल्म में फिक्स्टिव प्रसार को समतुल्य करने के लिए कई मिनट की आवश्यकता होती है। इस समय अवधि नमूना मोटाई के वर्ग के रूप में बढ़ जाती है, और बहुत मोटी बायोफिल्मया आगर ब्लॉक नमूनों के लिए एक घंटे या उससे अधिक तक बढ़ाया जाना चाहिए जो 2-3 मिमी मोटी हो सकती है। धुंधला करने के लिए समतुल्य समय अवधि भी नमूना मोटाई पर निर्भर करती है जैसा कि फिक्सिंग और वॉशआउट के लिए वर्णित है। हालांकि, क्योंकि लेक्टिन कम मेगावाट फिक्सेटिव की तुलना में अधिक धीरे-धीरे फैलाते हैं, विशेष रूप से एक आगर जेल के भीतर, धुंधला रातोंरात बढ़ाया जाना चाहिए। अतिरिक्त दाग की धुनाई के लिए भी ऐसा ही किया जाना चाहिए।

प्रोटोकॉल में विभिन्न प्रकार के दाग शामिल किए जा सकते हैं। हम संरचनात्मक इमेजिंग के लिए एक सेल दीवार दाग का उपयोग करते हैं, सबसे अधिक कैलकोफ्लोर व्हाइट M2R (फ्लोर। ब्राइटनर #28) या एक रंग-टैग किए गए लेक्टिन जैसे कोना-एलेक्साफ्लोर 594 या डब्ल्यूजीए-एलेक्साफ्लोर 594। प्रोटीन की वैलेंटी पर ध्यान दिया जाना चाहिए। कोना टेट्रामर एक बायोफिल्म के एपिकल क्षेत्र में अत्यधिक लचीला हाइफे की क्रॉसलिंकिंग का कारण बन सकता है। यह WGA डामर के साथ कम स्पष्ट है। इन मार्कर की विहित विशिष्टताएं चिटिन के लिए कैल्कोफ्लोर, मैननोस अवशेषों के लिए कोना, और एन-एसीटाइल-डी-ग्लूकोसामाइन और सियालिक एसिड अवशेषों के लिए डब्ल्यूजीए हैं।

क्योंकि सॉल्वेंट एक्सचेंज प्रोटोकॉल पीबीएस या पानी से वर्गीकृत है, हालांकि मेथनॉल मिथाइल सालिसिलेट में, नमूना कंटेनरों को विलायक प्रतिरोधी होना चाहिए। मिथाइल सालिसिलेट (एमएस) पॉलीस्टीरिन प्लास्टिकवेयर को जल्दी नरम करेगा और धीरे-धीरे अन्य प्लास्टिक को नरम करेगा। प्रोटोकॉल साफ मेथनॉल के उपयोग के लिए कदम प्लास्टिक के बर्तन में किया जा सकता है, लेकिन प्रोटोकॉल में उस बिंदु पर हम आम तौर पर विलायक प्रतिरोधी पेंच टोपियां के साथ मानक 20 एमएल ग्लास प्रस्फुटन शीशियों पर स्विच करते हैं । शीशियां सिलिकॉन स्क्वायर सबस्ट्रैटा पर बायोफिल्म्स के लिए सुविधाजनक हैं, क्योंकि चौकों को ठीक चिमटी का उपयोग करके उठाया और स्थानांतरित किया जा सकता है। इसके अलावा, एक शीशी को सूखा और आंतरिक घुमावदार सतह पर आराम करने वाले फ्लैट वर्ग से फिर से भरा जा सकता है ताकि बायोफिल्म ग्लास से संपर्क न करे। उपस्तर पर जब ईमानदार शीशी में डूब जाता है तो बायोफिल्म-अप होना चाहिए। शीशियां दीर्घकालिक नमूना भंडारण के लिए उत्कृष्ट हैं।

स्पष्टीकरण प्रोटोकॉल में, अधिक वर्गीकृत सॉल्वेंट एक्सचेंज चरण सॉल्वेंट मिश्रण प्रभावों के कारण नमूना विरूपण के जोखिम को कम करते हैं। बुनियादी प्रोटोकॉल में गति और सुविधा के लिए, चार चरण हैं: 1) चरण 3.3, पीबीएस से 50:50 पीबीएस: मेथनॉल; 2) चरण 3.4 और 3.5, पीबीएस: मेथनॉल से साफ मेथनॉल, 3) चरण 3.6, साफ मेथनॉल से 50:50 मेथनॉल: एमएस; और 4) चरण 3.7 और 3.8, मेथनॉल: एमएस से साफ एमएस मेथनॉल संक्रमणकालीन गलतता प्रदान करता है। हालांकि, क्योंकि पानी और एमएस लगभग अचूक हैं, यह आवश्यक है कि किसी भी एमएस की शुरुआत से पहले सभी पानी को मेथनॉल द्वारा विस्थापित किया जाए इसी तरह, क्योंकि मेथनॉल अत्यधिक अस्थिर है, एमएस द्वारा सभी मेथनॉल को विस्थापित करना महत्वपूर्ण है अन्यथा, जारी रखा गया अवशिष्ट मेथनॉल के वाष्पीकरण से नमूने के भीतर अपवर्तक सूचकांक भिन्नता होगी। चार चरण अनुक्रम के भीतर, साफ विलायक, या यहां तक कि एक तिहाई परिवर्तन के एक और परिवर्तन को जोड़कर दूसरे और चौथे चरण को दोहराने की सलाह दी जाती है। विशेष रूप से नाजुक नमूनों के लिए, विलायक परिवर्तन छोटे प्रतिशत चरणों में तैयार किया जा सकता है ।

आगर ब्लॉक नमूनों के साथ, मेथनॉल में अवशिष्ट पीबीएस लवण की अघुलनशीलता के कारण आगर के भीतर नमक क्रिस्टल की उपस्थिति का कारण बन सकता है। पानी के दौरान लवण को पतला करने के लिए पीबीएस के स्थान पर पहले मिश्रित विलायक चरण में आसुत पानी (DW) का उपयोग करके इससे बचा जा सकता है: मेथनॉल एक्सचेंज। फिक्स्ड बायोफिल्म्स के लिए वैकल्पिक विलायक विनिमय अनुक्रम में ये चरण होते हैं: 1) चरण 3.3, नमूना को पीबीएस से 50:50 DW में स्थानांतरित करें: मेथनॉल (आगर के माध्यम से प्रसार के लिए अतिरिक्त समय की अनुमति दें); 2) चरण 3.4, नमूना को 50:50 DW से स्थानांतरित करें: मेथनॉल को साफ मेथनॉल में (चरण 3.5 के रूप में मेथनॉल के साथ 2x दोहराएं); 3) चरण 3.6, नमूना को मेथनॉल से 50:50 मेथनॉल में स्थानांतरित करें: मिथाइल सालिसिलेट; और 4) चरण 3.7, नमूना को 50:50 मेथनॉल से स्थानांतरित करें: एमएस को साफ एमएस में (एमएस के साथ 2x को चरण 3.8 में दोहराएं)।

क्योंकि मिथाइल सालिसाइलेट पॉलीस्टीरिन प्लास्टिकवेयर को जल्दी से नरम करता है, हम एक उल्टे माइक्रोस्कोप के चरण पर स्पष्ट बायोफिल्म को पकड़ने के लिए कवर ग्लास बॉटम के साथ एक एनोडाइज्ड एल्यूमीनियम डिश का उपयोग करते हैं। कवर ग्लास यूवी-इलाज ऑप्टिकल सीमेंट (नॉर्लैंड ऑप्टिकल चिपकने वाला #61, सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके आयोजित किया जाता है। बशर्ते एमएस को दिन के अंत में आइसोप्रोपेनॉल के साथ डिश धोकर हटा दिया जाता है और उसके बाद साबुन के पानी और रिंसिंग होते हैं, सीमेंटेड कवर ग्लास कई महीनों तक काम करेगा ।

गोलाकार विचलन को कम करने और पर्याप्त कार्य दूरी की आवश्यकता के महत्व के कारण स्पष्ट नमूनों की बड़े पैमाने पर इमेजिंग में वस्तुनिष्ठ लेंस चयन गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। इन अध्ययनों में तीन उद्देश्यों के साथ हमारे पास अनुभव है । उल्टे माइक्रोस्कोप सेटअप में, हम कवर ग्लास के ऊपर पकवान में मिथाइल सालिसिलेट में डूबे बायोफिल्म के साथ कवर ग्लास के नीचे डूबे एक लंबी कामकाजी दूरी, मध्यम संख्यात्मक एपर्चर (एनए) ऑब्जेक्टिव ऑयल का उपयोग करते हैं। हमारा अधिकांश काम ज़ीस यूनिवर्सल श्रृंखला एक्रोमेटिक उद्देश्य, प्रकार 461708, 40x 0.85ए ओएल 160/1.5 के साथ किया गया है, जिसका उपयोग अनंत-संजूगेट (आईसी) अनुकूलता के लिए नकारात्मक 160 मिमी फोकल लेंथ एडाप्टर के साथ किया जाता है। यह उद्देश्य मूल रूप से 0.35 मिमी वर्किंग डिस्टेंस25के साथ 1.5 मिमी माइक्रोस्कोप स्लाइड के माध्यम से डूबे तेल के लिए डिज़ाइन किया गया था। जब एक मानक कवर ग्लास (0.17 मिमी) के साथ उपयोग किया जाता है, तो कामकाजी दूरी बहुत अधिक होती है: 1.5 + 0.35-0.17 = 1.68 मिमी = 1,680 माइक्रोन। हम एक नए Zeiss बहु-विसर्जन उद्देश्य, टाइप 420852, 25x 0.8 एनएएल एलएल एलसीआई योजना-एपोक्रोमेट का उपयोग 540 माइक्रोन से अधिक काम करने वाली दूरी के साथ करते हैं, विसर्जन सुधार के साथ 'तेल' के उच्च पक्ष में सेट होता है। यह उद्देश्य अत्यधिक सही है और एक शानदार छवि पैदा करता है। एक ईमानदार माइक्रोस्कोप स्टैंड पर, हमने एक नए निकॉन बहु-विसर्जन उद्देश्य, टाइप MRD71120, 10x 0.5NA CFI योजना-apochromat का उपयोग किया है, जिसमें 5,000 माइक्रोन (5 मिमी) से अधिक काम करने वाली दूरी है, साथ ही 'तेल' (एन = 1.518) के उच्च पक्ष में स्थापित विसर्जन सुधार के साथ। हालांकि इस उद्देश्य में दूसरों की तुलना में कम एनए है, लेकिन मिथाइल सालिसिलेट में सीधे विसर्जित होने का लाभ है।

गति और संकल्प के संदर्भ में डेटा अधिग्रहण का अनुकूलन करने के लिए, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सेटिंग्स को आदर्श रूप से ट्रांसवर्स और अक्षीय Nyquist नमूना घनत्व18दोनों को पूरा करना चाहिए। पारंपरिक मानदंडों का उपयोग करते हुए, कॉन्फोकल पिनहोल व्यास को नाममात्र 1 हवादार इकाई में सेट करें। बढ़ाया निर्देशांक में,

डीपी (μm) = 1.22 x आवर्धन एक्स (μm में उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य) /

ट्रांसवर्स सैंपलिंग (पिक्सल स्पेसिंग) एक्स एब की रिजॉल्यूशन लिमिट (1/2) से ज्यादा नहीं होनी चाहिए । ऑब्जेक्ट-स्पेस निर्देशांक में,

‧x, ‧y = (एनएम में उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य) / (4 एनए)

अक्षीय नमूना (फोकस वेतन वृद्धि) विलोम अक्षीय बैंडविड्थ से अधिक नहीं होना चाहिए,

‧z = (विसर्जन सूचकांक) एक्स (एनएम में उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य) / (एनए2)

कॉन्फोकल ऑप्टिकल सिस्टम माइक्रोस्कोप की बैंडविड्थ का विस्तार करता है और ट्रांसवर्स और अक्षीय संकल्प दोनों को कम से कम 1/√ 2 तक तेज करता है।

40x 0.85 एनए उद्देश्य के लिए कि हम सबसे अधिक बार उपयोग करते हैं, 600 एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (एलेक्सा फ्लोर 594) के लिए इन सूत्रों के परिणामों के लिए तालिका 1 देखें।

सूत्र x 1/√ 2 सेट (विशिष्ट)
डीपी (μm) 34.5 माइक्रोन - 25 या 50 माइक्रोन
‧x, ‧y 176 एनएम 125 एनएम 161 एनएम
‧z 1200 एनएम 848 एनएम 900 एनएम

तालिका 1: 600 एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के लिए कॉन्फोकल पिनहोल व्यास, ट्रांसवर्स नमूना, और अक्षीय नमूना मूल्य।

इन सेटिंग्स और 1,392 x 1,040 पिक्सल स्कैन फील्ड के साथ कताई-डिस्क कॉन्फोकल स्कैनर का उपयोग करके, बायोफिल्म नमूनों से डेटा उचित गति और संकल्प के साथ प्राप्त किया जा सकता है। विशिष्ट एकल रंग 3 डी छवि ढेर 0.35-1.55 जीबी चलाते हैं।

व्यापक उपयोग में स्पष्टीकरण मीडिया एक महत्वपूर्ण अपवर्तक सूचकांक रेंज अवधि। डार्कफील्ड रोशनी और दृश्य निरीक्षण द्वारा, हमने पाया कि फिक्स्ड सी एल्बिकान बायोफिल्म्स एन = 1.5 से ऊपर सबसे पारदर्शी थे। यह चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा एन = 1.530-1.535 को परिष्कृत किया गया था। कई व्यावहारिक कारणों से, हम अंतिम सूचकांक मिलान सॉल्वेंट के रूप में मिथाइल सालिसिलेट (एन = 1.537) का उपयोग करते हैं। हालांकि विलायक विनिमय नमूना विरूपण या अन्य कलाकृतियों का खतरा लाता है, निश्चित, स्पष्ट नमूनों में कोशिकाओं में समान कोशिका शरीर आयाम, हाइहा व्यास और जीवित नमूनों के रूप में इंटरसेप्टल लंबाई आयाम होते हैं।

सॉल्वेंट एक्सचेंज प्रक्रिया में कई भिन्नताएं संभव हैं (उदाहरण के लिए, एक अलग संक्रमणकालीन विलायक, या एक अलग अंतिम विलायक का उपयोग करना)। मेथनॉल को इसके उच्च ध्रुवता और तेजी से प्रसार के लिए चुना गया था, लेकिन इथेनॉल को एक संक्रमणकालीन विलायक के रूप में लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) क्वांटम यील्ड26 को बेहतर ढंग से संरक्षित करने के लिए दिखाया गया था। मिथाइल सालिसिलेट को इसके सूचकांक, मध्यम ध्रुवीकरण, कम वाष्प दबाव और कई दाग, रंगों और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ अनुकूलता के लिए चुना गया था। हालांकि, थोड़ा कम सूचकांक के साथ एक अंतिम विलायक, या मिथाइल सालिसिलेट का मिश्रण और ब्यूटानोल जैसे कम इंडेक्स सॉल्वेंट, बेहतर सेवा कर सकते हैं।

अप्रत्याशित रूप से, बायोफिल्म के माध्यम से देखने की क्षमता न केवल इसकी स्तरीकृत आंतरिक विशेषताओं का पता चलता है, बल्कि विस्तारित संरचनाओं की उत्पत्ति को देखने में भी सहायक होता है जैसे कि कुछ उपस्तर पर लंबे, अनउलझए हुए एपिकल हाइफे और आक्रामक बेसल हाइफे। सी एल्बिकान में अवसरवादी उग्रता इसकी आनुवंशिक बहुमुखी प्रतिभा (यानी, हाइफाल विकास के लिए स्विचओवर, सेल सबस्ट्रेटम और सेल पालन, सेल नवोदित और विस्तार के लिए ओस्मोलाइट्स की पीढ़ी, और वैकल्पिक पोषक तत्वों का उपयोग) पर निर्भर करती है। हाइफाल एक्सटेंशन फागोसाइटिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं से व्यक्तिगत सी एल्बिकान कोशिकाओं के ब्रेकआउट को सक्षम बनाता है, लेकिन आक्रमण के लिए भी आवश्यक है। बायोफिल्म आसंजन और हाइफाल उलझन एक उपस्तर पर कुशलतापूर्वक आक्रमण करने के लिए हाइफे के लिए आवश्यक सतह प्रस्तोता प्रदान करने के लिए दिखाई देते हैं। जब वह सबस्ट्रेटम होस्ट टिश्यू होता है, तो उग्रता में वृद्धि का परिणाम हो सकता है।

इमेजिंग अक्षुण्ण बायोफिल्मजीन अभिव्यक्ति, मॉडल ऊतक उपस्तर के लिए रिपोर्टर उपभेदों का उपयोग करने वाले जानकारीपूर्ण प्रयोगों की एक विशाल संख्या और प्राकृतिक बायोफिल्मों में पाए जाने वाले बैक्टीरिया जैसे अन्य जीवों को शामिल करने में सक्षम बनाता है। यहां तक कि एक सेल दीवार दाग के साथ विशुद्ध रूप से संरचनात्मक इमेजिंग के सरलतम मामले में, सीटू फेनोटाइप में पता चला है कि तब मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और आनुवंशिक रूप से विश्लेषण किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को NIH अनुदान R01 AI067703, R21 AI100270, और R21 AI135178 द्वारा एपी मिशेल को समर्थन दिया गया था । लेखक इस काम में उपयोग किए जाने वाले लंबे काम करने वाली दूरी के तेल विसर्जन उद्देश्य को प्रदान करने के लिए ग्रीनफील्ड 'किप' स्लडर के आभारी हैं, और डैनियल शिवारस्की को प्रत्यक्ष मिथाइल सालिसिलेट विसर्जन के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biohazardous waste receptacle
Biosafety cabinet with germicidal UV lamp
Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol)
Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate
Distilled water DW
Distilled water, sterile
Ethanol, absolute EtOH
Fetal bovine serum (FBS), sterile
Fixative waste bottle in secondary containment
Formaldehyde 20% in water, ampules Electron Microscopy Sciences
Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% Electron Microscopy Sciences
Fume hood
Glutaraldehyde 25% in water, ampules Electron Microscopy Sciences
Incubator - 30 °C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes
Incubator - 37 °C, with orbital mixer for culture plates
Isopropanol 70% iPrOH 70%
Longwave (365 nm) UV lamp, 5 W Cole-Parmer Scientific for curing NOA-61 cement
Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ Non-reinforced medical grade silicone sheeting
Methanol 99.9% MeOH
Methyl salicylate 99% MS
Millipore Swinnex 13 mm white silicone ring gaskets Millipore Corp. SX0001301
Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61 Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com NOA-61
Orbital mixer, benchtop
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile
Refractive index standard liquids, n = 1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) Cargille Laboratories, https://cargille.com Series E Cedar Grove, NJ 07009, USA
RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile
Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner Fisher Scientific Co. 03-341-25H for specimen processing and storage
Solvent waste bottle in secondary containment
Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol)
Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate
Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar)
YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose)

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References

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इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन इश्यू 157 कैंडिडा एल्बिकान्स,बायोफिल्म अपवर्तक इंडेक्स मैचिंग मिथाइल सालिसिलेट स्पष्टीकरण कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी
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Lanni, F., Lagree, K., Huang, M. Y., Yan, L., Woolford, C. A., Mitchell, A. P. Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms. J. Vis. Exp. (157), e60718, doi:10.3791/60718 (2020).

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