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Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Worcester Polytechnic Institute

&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x662F;&#x5236;&#x5B9A;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x5FEB;&#x901F;&#x751F;&#x6210;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x5316;&#x7684;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x6784;&#x9020;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x805A;&#x5408;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E0E;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5916;&#x57FA;&#x8D28; (ECM)&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E0E;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x3002;&#x5927;&#x9F20;&#x4E3B;&#x52A8;&#x8109;&#x5E73;&#x6ED1;&#x808C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6210;&#x73AF;&#x5F62;&#x743C;&#x8102;&#x7CD6;&#x6C34;&#x4E95; &#xFF08;2&#x3001; 4 &#x6216; 6 &#x6BEB;&#x7C73;&#x5185;&#x5F84;&#xFF09; &#x805A;&#x5408;&#x548C;&#x9759;&#x6001;&#x6587;&#x5316; (0.76 &#x6BEB;&#x7C73;&#x5728; 8 &#x5929; &#xFF1B; &#x5728; 14 &#x5929;&#x7684; 0.94 &#x6BEB;&#x7C73;) &#x7684; 2 &#x5468;&#x5185;&#x5F62;&#x6210;&#x539A;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x73AF;&#x3002;&#x603B;&#x4F53;&#x800C;&#x8A00;&#xFF0C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x51FA;&#x73B0;&#x5065;&#x5EB7;&#x548C;&#x5305;&#x56F4; ECM &#x7EC4;&#x6210;&#x7684; glycosoaminoglycans &#x548C;&#x9AA8;&#x80F6;&#x539F;&#xFF0C;&#x867D;&#x7136;&#x6700;&#x539A;&#x7684;&#x73AF;&#x7684;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x9644;&#x8FD1;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684;&#x574F;&#x6B7B;&#x8FF9;&#x8C61;&#x3002;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x73AF;&#x7684;&#x5F3A;&#x5EA6;&#x548C;&#x521A;&#x5EA6;&#x503C;&#x9AD8;&#x4E8E;&#x90A3;&#x4E9B;&#x62A5;&#x544A;&#x7684;&#x53EF;&#x6BD4;&#x6B21;&#x57F9;&#x517B;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x5316;&#x7684;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x6784;&#x9020;&#x3002;(100-500 &#x5343;&#x5E15;) &#x5F3A;&#x5EA6;&#x548C;&#x6A21;&#x91CF; (0.5-2 m p a&#xFF09; &#x7EC4;&#x7EC7;&#x7684;&#x73AF;&#x4E0E;&#x73AF;&#x5927;&#x5C0F;&#x589E;&#x52A0;&#xFF0C;&#x800C;&#x6587;&#x5316;&#x6301;&#x7EED;&#x65F6;&#x95F4;&#x51CF;&#x5C11;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x73AF;&#x7845;&#x80F6;&#x9876;&#x5934; 7 &#x5929;&#x7EC6;&#x80DE;&#x878D;&#x5408;&#x5230;&#x7A97;&#x4F53;&#x7BA1;&#x72B6;&#x6784;&#x9020;&#x3002;&#x73AF;&#x8FB9;&#x8DDD;&#x90FD;&#x53EF;&#x89C1;&#xFF0C;&#x7ECF;&#x8FC7; 7 &#x5929;&#xFF0C;&#x4F46;&#x7BA1;&#x662F;&#x51DD;&#x805A;&#x529B;&#x548C;&#x673A;&#x68B0;&#x7A33;&#x5B9A;&#x548C;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x5B66;&#x68C0;&#x67E5;&#x8BC1;&#x5B9E;&#x73AF;&#x4E9A;&#x57FA;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x878D;&#x5408;&#x3002;&#x8FD9;&#x72EC;&#x7279;&#x7684;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4F18;&#x5316;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x8BC4;&#x4F30;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7EC4;&#x7EC7;&#xFF0C;&#x5E76;&#x521B;&#x5EFA;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x8840;&#x7BA1;&#x79FB;&#x690D;&#x7684;&#x65B0;&#x65B9;&#x6CD5;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x4E00;&#x4E2A;&#x591A;&#x624D;&#x591A;&#x827A;&#x7684;&#x65B0;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;

&#x5DE5;&#x7A0B;&#x4ECE;&#x805A;&#x5408;&#x7684;&#x5E73;&#x6ED1;&#x808C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x634F;&#x9020;&#x7684;&#x8840;&#x7BA1;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x3002;

The goal of this study was to develop a system to rapidly generate engineered tissue constructs from aggregated cells and cell-derived extracellular matrix (ECM) to enable evaluation of cell-derived tissue structure and function. Rat aortic smooth muscle cells seeded into annular agarose wells (2, 4 or 6 mm inside diameter) aggregated and formed thick tissue rings within 2 weeks of static culture (0.76 mm at 8 days; 0.94 mm at 14 days). Overall, cells appeared healthy and surrounded by ECM comprised of glycosoaminoglycans and collagen, although signs of necrosis were observed near the centers of the thickest rings. Tissue ring strength and stiffness values were superior to those reported for engineered tissue constructs cultured for comparable times. The strength (100-500 kPa) and modulus (0.5-2 MPa) of tissue rings increased with ring size and decreased with culture duration. Finally, tissue rings cultured for 7 days on silicone mandrels fused to form tubular constructs. Ring margins were visible after 7 days, but tubes were cohesive and mechanically stable, and histological examination confirmed fusion between ring subunits. This unique system provides a versatile new tool for optimization and functional assessment of cell-derived tissue, and a new approach to creating tissue-engineered vascular grafts.

Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.

L&#x26;#39;objectif de cette &#xE9;tude &#xE9;tait de d&#xE9;velopper un syst&#xE8;me permettant de g&#xE9;n&#xE9;rer rapidement des constructions de l&#x26;#39;ing&#xE9;nierie tissulaire &#xE0; partir de cellules agr&#xE9;g&#xE9;es et d&#xE9;riv&#xE9; des cellules de la matrice extracellulaire (MEC) pour permettre une &#xE9;valuation de la structure des tissus d&#xE9;riv&#xE9;s de cellules et la fonction. Rat des cellules musculaires lisses aortiques ensemenc&#xE9;es dans les puits d&#x26;#39;agarose annulaire (2, 4 ou 6 mm de diam&#xE8;tre int&#xE9;rieur) regroup&#xE9;es et ont form&#xE9; des anneaux de tissu &#xE9;pais dans les 2 semaines de culture statique (0,76 mm &#xE0; 8 jours; 0,94 mm &#xE0; 14 jours). Dans l&#x26;#39;ensemble, les cellules semblait en bonne sant&#xE9; et entour&#xE9; par ECM compos&#xE9;e de glycosoaminoglycans et de collag&#xE8;ne, bien que des signes de n&#xE9;crose ont &#xE9;t&#xE9; observ&#xE9;es &#xE0; proximit&#xE9; des centres les plus &#xE9;paisses de bagues. La force anneau de tissu et des valeurs de rigidit&#xE9; ont &#xE9;t&#xE9; sup&#xE9;rieurs &#xE0; ceux rapport&#xE9;s pour de l&#x26;#39;ing&#xE9;nierie tissulaire construit cultiv&#xE9;es pendant des temps comparables. La force (100-500 kPa) et le module (0.5-2 MPa) des anneaux de tissu a augment&#xE9; avec la taille du cycle et diminue avec la dur&#xE9;e de la culture. Enfin, les anneaux de tissus cultiv&#xE9;s pendant 7 jours sur mandrins en silicone fusionn&#xE9; pour former des constructions tubulaires. Marges anneaux &#xE9;taient visibles au bout de 7 jours, mais les tubes ont &#xE9;t&#xE9; coh&#xE9;rente et m&#xE9;caniquement stable, et l&#x26;#39;examen histologique a confirm&#xE9; la fusion entre les sous-unit&#xE9;s cycliques. Ce syst&#xE8;me unique fournit un outil polyvalent nouvelle pour l&#x26;#39;optimisation et l&#x26;#39;&#xE9;valuation fonctionnelle de la cellule d&#xE9;riv&#xE9;e du tissu, et une nouvelle approche &#xE0; la cr&#xE9;ation de l&#x26;#39;ing&#xE9;nierie tissulaire greffons vasculaires.

Con&#xE7;u tissus vasculaires Fabriqu&#xE9; &#xE0; partir de cellules musculaires lisses agr&#xE9;g&#xE9;es

Das Ziel dieser Studie war es, die Entwicklung eines Systems zum schnell generieren ver&auml;nderte Gewebe Konstrukte aus aggregierten Zellen und Zellen abgeleiteten extrazellul&auml;ren Matrix (ECM) Bewertung der Cell-derived Gewebestruktur und Funktion zu aktivieren. Ratte Aorten glatten Muskelzellen ausges&auml;t in ringf&ouml;rmigen Agarose Wells (2, 4 oder 6 mm Innendurchmesser) aggregiert und dicken Gewebe Ringe innerhalb von 2 Wochen nach statische Kultur (0,76 mm 8 Tage; 0,94 mm 14 Tage) gebildet. Insgesamt erschienen Zellen gesund und umgeben von ECM, bestehend aus Glycosoaminoglycans und Kollagen, zwar Anzeichen f&uuml;r eine Nekrose in der N&auml;he der Zentren der dicksten Ringe beobachtet wurden. Gewebe Ring Festigkeit und Steifigkeit Werte waren &uuml;berlegen berichtete f&uuml;r technische Gewebe-Konstrukte, die f&uuml;r vergleichbare Zeiten kultiviert. Die St&auml;rke (100-500 kPa) und Modulo (0.5-2 MPa) des Gewebes Ringe mit Ringgr&ouml;&szlig;e erh&ouml;ht und sank mit Kultur-Dauer. Schlie&szlig;lich verschmolzen Gewebe Ringe kultiviert f&uuml;r 7 Tage auf Silikon Dorne auf tubul&auml;re Form-Konstrukte. Ring R&auml;nder sichtbar waren, nach 7 Tagen, aber Schl&auml;uche wurden Zusammenhalt und mechanisch stabil und histologische Untersuchung best&auml;tigt Fusion zwischen Ring-Untereinheiten. Dieses einzigartige System bietet ein vielseitiges neues Werkzeug f&uuml;r die Optimierung und funktionale Bewertung der Cell-derived Gewebe und einen neuen Ansatz zum Erstellen von Tissue-engineered vaskul&auml;rer Prothesen.

Vaskul&auml;re Gewebe hergestellt aus aggregierten glatten Muskelzellen entwickelt.

L&#39;obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un sistema per generare rapidamente costrutti tessuto ingegnerizzato da aggregati di cellule e cellule derivate di matrice extracellulare (ECM) per consentire la valutazione delle cellule derivate tessuto struttura e funzione. Cellule del muscolo liscio aortiche ratto teste di serie dell&#39;agarosi anulare pozzi (2, 4 o 6 mm diametro interno) aggregati e formano anelli di tessuto spesso entro 2 settimane di coltura statica (0,76 mm a 8 giorni; 0,94 mm a 14 giorni). Nel complesso, le cellule apparvero sano e circondato da ECM composto da glycosoaminoglycans e collagene, anche se sono stati osservati segni di necrosi nei pressi dei centri degli anelli pi&ugrave; grossa. Valori di resistenza e rigidezza di anello di tessuto sono stati superiori a quelli segnalati per costrutti ingegnerizzati tessuto in coltura per tempi comparabili. La forza (100-500 kPa) e modulo (0,5-2 MPa) del tessuto anelli aumentato con dimensione anello e diminuito con durata di cultura. Infine, gli anelli di tessuto coltivati per 7 giorni su mandrini in silicone fuso a costrutti di forma tubolare. Anello margini erano visibili dopo 7 giorni, ma tubi erano meccanicamente stabile e coesa e l&#39;esame istologico ha confermato la fusione tra le subunit&agrave; anello. Questo sistema unico fornisce un nuovo strumento versatile per ottimizzazione e valutazione funzionale del tessuto di cellule derivate e un nuovo approccio alla creazione di innesti vascolari tessutale.

Engineered tessuto vascolare fabbricato da cellule muscolari lisce aggregati.

&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x76EE;&#x7684;&#x306F;&#x3001;&#x8FC5;&#x901F;&#x306B;&#x96C6;&#x7D04;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x7531;&#x6765;&#x306E;&#x7D44;&#x7E54;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3092;&#x6709;&#x52B9;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x7531;&#x6765;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#xFF08;ECM&#xFF09;&#x304B;&#x3089;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7D44;&#x7E54;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002; &#xFF08;; 14&#x65E5;&#x306B;0.94&#x30DF;&#x30EA;&#x30E1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30EB;8&#x65E5;&#x306B;0.76&#x30DF;&#x30EA;&#x30E1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30EB;&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x5927;&#x52D5;&#x8108;&#x5E73;&#x6ED1;&#x7B4B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x3001;&#x74B0;&#x72B6;&#x30A2;&#x30AC;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B9;&#x4E95;&#x6238;&#xFF08;2&#x3001;&#x5185;&#x5F84;4&#x301C;6 mm&#xFF09;&#x3092;&#x96C6;&#x7D04;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x9759;&#x7F6E;&#x57F9;&#x990A;&#x306E;2&#x9031;&#x9593;&#x4EE5;&#x5185;&#x306B;&#x539A;&#x3044;&#x7D44;&#x7E54;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x64AD;&#x7A2E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x58CA;&#x6B7B;&#x306E;&#x5146;&#x5019;&#x304C;&#x592A;&#x3044;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x4ED8;&#x8FD1;&#x306B;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3082;&#x306E;&#x306E;&#x3001;&#x5168;&#x4F53;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x3001;&#x5065;&#x5EB7;&#x73FE;&#x308C;&#x3001;glycosoaminoglycans&#x3068;&#x30B3;&#x30E9;&#x30FC;&#x30B2;&#x30F3;&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x308B;ECM&#x306B;&#x56F2;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D44;&#x7E54;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x5F37;&#x5EA6;&#x3068;&#x525B;&#x6027;&#x306E;&#x5024;&#x306F;&#x540C;&#x7B49;&#x306E;&#x6642;&#x9593;&#x57F9;&#x990A;&#x3057;&#x305F;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x7D44;&#x7E54;&#x69CB;&#x7BC9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5831;&#x544A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3082;&#x306E;&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x512A;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;&#x7D44;&#x7E54;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x5F37;&#x3055;&#xFF08;100&#x301C;500 kPa&#xFF09;&#x3068;&#x3001;&#x5F3E;&#x6027;&#x7387;&#xFF08;0.5-2 MPA&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x3068;&#x3068;&#x3082;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x3001;&#x57F9;&#x990A;&#x671F;&#x9593;&#x3068;&#x3068;&#x3082;&#x306B;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x30B7;&#x30EA;&#x30B3;&#x30FC;&#x30F3;&#x30DE;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EC;&#x30EB;&#x4E0A;&#x3067;7&#x65E5;&#x9593;&#x57F9;&#x990A;&#x7D44;&#x7E54;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x304C;&#x7BA1;&#x72B6;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x878D;&#x5408;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x3002;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x30DE;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x306F;7&#x65E5;&#x5F8C;&#x306B;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x30C1;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D6;&#x304C;&#x51DD;&#x96C6;&#x3057;&#x3001;&#x6A5F;&#x68B0;&#x7684;&#x306B;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3057;&#x3001;&#x7D44;&#x7E54;&#x5B66;&#x7684;&#x691C;&#x67FB;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x9593;&#x306E;&#x878D;&#x5408;&#x3092;&#x78BA;&#x8A8D;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x306A;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x7531;&#x6765;&#x306E;&#x7D44;&#x7E54;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x7D44;&#x7E54;&#x5DE5;&#x5B66;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x8840;&#x7BA1;&#x3092;&#x4F5C;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x591A;&#x76EE;&#x7684;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x96C6;&#x7D04;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5E73;&#x6ED1;&#x7B4B;&#x7D30;&#x80DE;&#x304B;&#x3089;&#x4F5C;&#x88FD;&#x3057;&#x305F;&#x7D44;&#x307F;&#x63DB;&#x3048;&#x8840;&#x7BA1;&#x7D44;&#x7E54;

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El objetivo de este estudio fue desarrollar un sistema para generar r&#xE1;pidamente las construcciones de ingenier&#xED;a de tejidos de c&#xE9;lulas agregados y derivado de las c&#xE9;lulas de la matriz extracelular (MEC) para permitir la evaluaci&#xF3;n de la estructura del tejido derivado de c&#xE9;lulas y la funci&#xF3;n. Las c&#xE9;lulas del m&#xFA;sculo liso de aorta de rata sembradas en anular los pozos de agarosa (2, 4 o 6 mm de di&#xE1;metro interior) agregan y forman anillos gruesos de tejido dentro de 2 semanas de la cultura est&#xE1;tica (0,76 mm en 8 d&#xED;as, 0,94 mm en 14 d&#xED;as). En general, las c&#xE9;lulas apareci&#xF3; sano y rodeado por ECM compuesto de glycosoaminoglycans y el col&#xE1;geno, aunque los signos de necrosis se observaron cerca de los centros de los anillos m&#xE1;s gruesos. La fuerza del tejido del anillo y valores de rigidez fueron superiores a los reportados para construcciones de ingenier&#xED;a tisular se cultivaron durante tiempos similares. La fuerza (100-500 kPa) y el m&#xF3;dulo (0.5-2 MPa) de los anillos de tejido aumenta con el tama&#xF1;o del anillo y disminuy&#xF3; con la duraci&#xF3;n cultivo. Finalmente, los anillos de tejidos cultivados durante 7 d&#xED;as sobre mandriles de silicona fundida para formar construcciones tubulares. M&#xE1;rgenes del anillo eran visibles despu&#xE9;s de 7 d&#xED;as, pero los tubos eran cohesionada y estable mec&#xE1;nicamente, y el examen histol&#xF3;gico confirm&#xF3; la fusi&#xF3;n entre las subunidades del anillo. Este sistema &#xFA;nico proporciona una nueva herramienta vers&#xE1;til para la optimizaci&#xF3;n y evaluaci&#xF3;n funcional de las c&#xE9;lulas derivadas de tejido, y un nuevo enfoque a la creaci&#xF3;n de la ingenier&#xED;a tisular injertos vasculares.

Tracy A. Gwyther

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