الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد لخلايا سرطان الرئة مع CAFs: نظام نموذج في المختبر لدراسة تطور الورم

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Chen ، S. ، et al. نظام الزراعة المشتركة متعدد الأبعاد لنمذجة تطور سرطان حرشفية الرئة.J. Vis. Exp.(2020)

يصف هذا الفيديو نظامي النموذج المختبري لالتقاط التغيرات المعمارية للأنسجة أثناء تطور سرطان الحرشفية الرئوي في ثقافة مشتركة ثلاثية الأبعاد (3D) مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان. يوفر هذا النظام منصة فريدة للتحقيق في دور التغيرات الجوهرية والخارجية التي تؤثر على النمط الظاهري للورم.

البروتوكول

1.تمرير واستزراع خلايا TUM622 و CAFs في الثقافات ثنائية الأبعاد

1. تمرير واستزراع خلايا TUM622
   1. وسط ثقافة ثلاثي الأبعاد دافئ وكواشف تفكك الخلايا (انظر جدول المواد) لخلايا TUM622 عند 37 درجة مئوية.
   2. مرور خلايا TUM622 عند التقاء 80٪ في قوارير ثنائية الأبعاد. عادة ، يحدث هذا بعد أسبوع واحد من المرور.
   3. تخلص من الوسط القديم من قارورة T75 واغسلها مرة واحدة باستخدام 6 مل من محلول HEPES. تجنب سحب العينة مباشرة على الخلايا.
   4. استنشاق المخزن المؤقت HEPES. أضف 4 مل من التربسين / EDTA (0.25 مجم / مل ، انظر جدول المواد) لشطف سريع وتخلص من التربسين / EDTA.
   5. أضف 2 مل من التربسين / EDTA واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة القوارير من الحاضنة واضغط على القوارير لفك الخلايا دون تكوين فقاعات هواء وأعد القوارير إلى الحاضنة لمدة 5 دقائق إضافية.
      ملاحظه: سيؤدي التعرض المطول للتربسين إلى إتلاف الخلايا بشكل لا رجعة فيه وتغيير نمطها الظاهري ، وبالتالي يوصى بالحد من الوقت الذي تتعرض فيه الخلايا للتربسين.
   6. تأكد من انفصال الخلايا وانفصالها تحت مجهر ضوئي (4x أو 10x). أضف 4 مل من المخزن المؤقت للتحييد (المخزن المؤقت TNS) (انظر معلومات كاشف الزراعة الفرعية في جدول المواد) متبوعا ب 10 مل من وسط الاستزراع ثلاثي الأبعاد (انظر جدول المواد).
   7. الماصة لأعلى ولأسفل برفق لفصل الخلايا بشكل أكبر باستخدام ماصة سعة 10 مل. انقل المعلق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
   8. عد أرقام الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي.
   9. البذور 0.8 × 10⁶ خلايا / قارورة T75 في 20 مل من وسط الثقافة ثلاثية الأبعاد (انظر جدول المواد).
   10. قم بتغذية الخلايا كل يومين عن طريق استبدال نصف الوسط المستهلك بوسط جديد.
2. تمرير وزراعة CAFs
   1. مرور CAFs عندما تصل الخلايا إلى التقاء. عادة ، يحدث هذا بعد 5 أيام من الزراعة من الانقسام 1: 2.
   2. تحضير وسط CAF باستخدام الوسط القاعدي RPMI مع 20٪ مصل بقري جنيني معطل للحرارة ، و 1٪ L-Glutamine و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. قم بتسخين المتوسط إلى 37 درجة مئوية.
   3. في قارورة T75 ، اشطف CAFs بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرة واحدة ثم أضف 2 مل من التربسين / EDTA واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   4. راقب تحت المجهر الضوئي للتأكد من انفصال الخلايا في القارورة (4x أو 10x). إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتمديد الحضانة لمدة 2-3 دقائق أخرى.
   5. بمجرد انفصال الخلايا وتفككها ، أضف 10 مل من وسط الثقافة ثلاثية الأبعاد لتحييد التربسين / EDTA والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لمزيد من فصل CAFs.
   6. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتدويره عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   7. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في حجم مناسب من وسط الثقافة ثلاثية الأبعاد (انظر جدول المواد) وانتقل إلى قارورتين جديدتين T75.

< p class = "jove_title" >2. طلاء خلايا TUM622 في المصفوفة خارج الخلية للزراعة ثلاثية الأبعاد

1. في اليوم السابق للتجربة ، قم بإذابة قوارير مصفوفة الغشاء القاعدي في ثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل. ماصات بلاستيكية للتهدئة (2 مل) وأطراف عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   ملاحظه: ليس كل الكثير من مصفوفة الغشاء القاعدي لها نفس القدرة على دعم النمو ثلاثي الأبعاد لخلايا TUM622. لذلك ، من الضروري الحصول على عدة مجموعات من مصفوفة الغشاء القاعدي واختبارها لتحديد تلك التي تدعم تكوين الأسيني القوي. عادة ، يتطلب هذا تركيزا أعلى من البروتين (16-18 مجم / مل) في المصفوفة.
2. في يوم التجربة ، وسط ثقافة ثلاثي الأبعاد دافئ ، عازلة HEPES ، التربسين / EDTA ومخزن تحييد التربسين (TNS) في حمام مائي 37 درجة مئوية. مباشرة قبل إعداد المزرعة ، أخرج مصفوفة الغشاء القاعدي المذابة من الثلاجة وضع القارورة على الثلج.
3. قم بتبريد ألواح زراعة الأنسجة على مبرد منصة معدنية موضوعة على الثلج. ضع أنابيب الطرد المركزي على رف تبريد معدني على الجليد.
4. باستخدام خلايا TUM622 التي تم الحصول عليها من الخطوة 1.1.7 ، احسب العدد المطلوب من الخلايا اللازمة للطلاء. عادة ، هناك حاجة إلى 15,000-30,0000 خلية لكل بئر من صفيحة 24 بئرا. الكثافة المنخفضة هي الأنسب للتصوير والقياس الكمي ، بينما تفضل الكثافة العالية عند جمع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي أو النشاف الغربي.
5. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مبرد (يحتوي كل أنبوب على خلايا للطلاء ثلاثي النسخ) وقم بالدوران عند 300 × جم في جهاز طرد مركزي دلو معلق عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
6. قم بشفط المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة شفط متصلة بطرف غير مفلتر (20 ميكرولتر)، مع ترك ما يقرب من 100 ميكرولتر من الوسط في الأنبوب (استخدم العلامات الموجودة على الأنبوب كدليل).
7. اضغط برفق على جانب الأنبوب لإزاحة الحبيبات وفصلها قبل إعادتها إلى رف التبريد.
8. باستخدام الماصات المبردة مسبقا سعة 2 مل، امزج المصفوفة برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات مع إبقاء القارورة على اتصال بالثلج. الماصة بسرعة متساوية ومعتدلة بحيث لا يتم إدخال فقاعات في المصفوفة أثناء هذا الإجراء.
9. انقل الحجم المناسب للمصفوفة إلى كل أنبوب طرد مركزي. لطلاء ثلاث نسخ في صفيحة 24 بئرا ، أضف 1.1 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى كل أنبوب.
10. باستخدام أطراف مبردة مسبقا ، قم بعمل الماصة في كل أنبوب لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات لعمل تعليق خلوي موحد.
11. انقل 310 ميكرولتر من تعليق الخلية / المصفوفة إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا مبردة مسبقا. يتم وضع الماصة بزاوية 90 درجة على سطح اللوحة ويضاف التعليق إلى وسط البئر. يجب أن ينتشر التعليق ويغطي البئر بالكامل دون الحاجة إلى إمالة اللوحة.
12. لتسهيل تحليل التألق المناعي في اتجاه مجرى النهر ، قم بوضع تعليق الخلية / المصفوفة بالتوازي في شرائح غرفة 2 بئر. انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية / المصفوفة إلى وسط بئر من شريحة غرفة 2 بئر (انظر جدول المواد). هذا يسمح للمصفوفة بتشكيل هيكل يشبه القبة بحجم أصغر بكثير.
13. أعد اللوحة وانزلق الغرفة مرة أخرى إلى حاضنة زراعة الأنسجة واحتضانها لمدة 30 دقيقة للسماح للمصفوفة بالتصلب. افحص اللوحة / الشريحة تحت المجهر الضوئي للتأكد من توزيع الخلايا المفردة بالتساوي داخل المصفوفة (4x أو 10x).
14. أضف 1 مل من الوسط الكامل للثقافة ثلاثية الأبعاد الدافئة مسبقا في كل بئر و 1.5 مل من وسط الثقافة ثلاثية الأبعاد إلى كل بئر من شريحة الغرفة ثم أعدها إلى الحاضنة.

3. 3D التثاقف لخلايا TUM622 و CAFs في المصفوفة خارج الخلية

1. تحضير معلقات الخلايا ل TUM622 و CAFs وفقا للقسم 2.
2. احسب كثافة خلايا CAF عن طريق أخذ 10 ميكرولتر من معلق الخلية وخلطها مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق.
3. أضف 10 ميكرولتر من الخليط إلى كل من الغرفتين على مقياس الدم لحساب وحساب كثافة الخلية.
   ملاحظه: CAFs لها أشكال غير منتظمة وقد لا يتم احتسابها بدقة على عداد خلوي أوتوماتيكي.
4. التضمين المشترك لخلايا TUM622 و CAFs في مصفوفة الغشاء القاعدي
   1. بناء على معلومات كثافة الخلية ، احسب العدد المطلوب من الخلايا المستخدمة في الطلاء. يتم زرع CAFs بنسبة 2: 1 من خلايا TUM622. على سبيل المثال ، بالنسبة ل 30,000 خلية TUM622 المصنفة ، يتم تضمين 60,000 CAFs بشكل مشترك.
   2. انقل الحجم المناسب من TUM622 بالإضافة إلى تعليق خلية CAFs إلى نفس أنبوب الطرد المركزي واتبع الخطوات 2.5-2.11 للطلاء في ألواح 24 بئرا. بالنسبة للتألق المناعي ، انقل 60 ميكرولتر من مزيج TUM622 / CAFs إلى شرائح الغرفة كما هو موضح في الخطوة 2.12).
5. التثقيف TUM622 مع CAFs المتراكبة في مصفوفة الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد)
   1. قم بإعداد TUM622 للثقافة الأحادية وفقا للخطوات 2.5-2.13.
   2. انقل ضعف عدد معلقات CAFs (مقارنة بعدد خلايا TUM622 البذرة) إلى أنبوب طرد مركزي وقم بالدوران عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق CAFs في 1 مل من وسط الثقافة ثلاثية الأبعاد.
   4. انقل 1 مل من تعليق CAFs إلى البئر الذي يحتوي على خلايا TUM622 المضمنة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كول راك CFT30 Biocision بي سي إس-138 لثقافة 3D كول سينك XT96F Biocision بي سي إس-536 لثقافة 3D Cultrex (مفضل للثقافة المشتركة) بيو تكني 3443-005-01 لثقافة 3D Lab-Tec II حجرة # 1.5 نظام الغطاء الألماني نالجي نونك الدولية 155379 (2) لثقافة 3D Lab-Tec II حجرة # 1.5 نظام الغطاء الألماني نالجي نونك الدولية 155409 (8) لثقافة 3D ل-جلوتامين جيبكو هاتف: 25030-081 ل CAFs Matrigel (مفضل للزراعة الأحادية) كورنينج 356231 لثقافة 3D كواشف الثقافة الفرعية ReagentPack لونزا سي سي -5034 لتفكك الخلايا TUM622 القلم / البكتيريا العقدية جيبكو 15140-122 ل CAFs FBS معطل بالحرارة جيبكو 10082-147 ل CAFs تريبل إكسبريس جيبكو 12604-021 لتفكك CAF مصفاة الخلية 40um ثيرموفيشر هاتف: 352340 لتمرير خلايا TUM622 RPMI ثيرموفيشر 11875-093 ل CAFs