A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

المصدر: Merenda، A. et al.، بروتوكول للضربة القاضية متعددة الجينات في العضيات المعوية الدقيقة للفأر باستخدام CRISPR-concatemer. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو تقنية خروج المغلوب الجيني باستخدام CRISPR-concatemer لضرب جينات متعددة في نفس الوقت في الخلايا العضوية المعوية للفأر المستنبتة. تستخدم هذه الطريقة لضرب الجين المصاب ولتوضيح وظيفة الجين وparalogues.

Protocol

1. تصميم gRNA لناقل CRISPR-concatemer

ملاحظة: الهدف من هذا القسم هو شرح كيفية اختيار أفضل استراتيجية استهداف وكيفية تصميم gRNAs التي تحتوي على نتوءات محددة لمتجه CRISPR-concatemer.

1. صمم الحمض النووي الريبي المرسال مقابل الجينات ذات الأهمية باستخدام أداة تصميم CRISPR gRNA المفضلة. انظر جدول المواد للحصول على مثال.
   ملاحظه: عند استهداف زوج من الجينات المتشاقة ، على الرغم من أنه من الممكن تصميم gRNA واحد لكل جين ، فمن المستحسن تصميم اثنين من gRNAs لكل جين لزيادة فرص تحقيق ضربة قاضية مزدوجة (الشكل 1).
2. تأكد من أن gRNAs لا تحتوي على موقع التعرف على BbsI باستخدام أداة تعيين التقييد (راجع جدول المواد للحصول على مثال).
3. أضف متجهات CRISPR-concatemer محددة إلى كل oligo ، كما هو موضح في الجدول 1.

2. استنساخ gRNAs في متجه CRISPR-concatemer

1. فسفرة وتلدين oligos
   ملاحظه: توضح هذه الخطوة كيفية تلدين الخيوط العلوية والسفلية لكل gRNA oligo وكيفية فسفرة نهاياتها في تفاعل واحد.
   1. تحضير خليط التفاعل لفسفرة أوليغوس وتلدين الخيوط العلوية والسفلية على الجليد ، وفقا للتعليمات أدناه.
      ملاحظه: يمكن تجميع جميع oligos في تفاعل واحد. على سبيل المثال ، في حالة ناقل 4 gRNA-concatemer ، قم بتجميع 8 oligos.
   2. بالنسبة إلى 3 متسلسلات ، استخدم 3.0 ميكرولتر من خيط gRNA العلوي (1.0 ميكرولتر من كل gRNA ؛ 10 ميكرومتر ، 1 ميكرولتر / جرنا) ، 3.0 ميكرولتر من خيط gRNA السفلي (1.0 ميكرولتر من كل gRNA ؛ 10 ميكرومتر ، 1 ميكرولتر / جرنا) ، 2.0 ميكرولتر T4 DNA ligase buffer (10x) ، 1.0 ميكرولتر T4 PNK ، وأضف H₂O حتى الحجم الإجمالي 20.0 ميكرولتر.
   3. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات وقم بتشغيلها في جهاز تدوير حراري باستخدام الإعدادات التالية: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، منحدر منخفض إلى 25 درجة مئوية عند 0.3 درجة مئوية / دقيقة ، استمر في 4 درجات مئوية.
2. BbsI خلط رد الفعل
   ملاحظه: في هذا القسم ، يتم دمج قلات الحمض النووي الريبي gRNA الملدنة مسبقا في الموضع المناسب للناقل المتسلسل في خطوة واحدة عن طريق دورات الهضم والربط بالتناوب.
   1. قم بتخفيف خليط التفاعل 1: 100 في الماء الخالي من DNase / RNase لتوليد 3 و 4 نواقل gRNA-concatemer.
      ملاحظه: عند استنساخ 2 gRNA-concatemers ليست هناك حاجة إلى هذه الخطوة.
   2. قم بتجميع رد فعل خلط BbsI على الجليد ، وفقا للتعليمات أدناه. قم بتضمين عنصر تحكم سلبي يحتوي فقط على المتجه.
   3. استخدم 100 نانوغرام من ناقل CRISPR-concatemer ، و 10.0 ميكرولتر من خليط oligo ، و 1.0 ميكرولتر من محلول إنزيم التقييد المحتوي على BSA (10x) ، و 1.0 ميكرولتر DTT (10 مللي مولار) ، و 1.0 ميكرولتر ATP (10 مللي مولار) ، و 1.0 ميكرولتر BbsI ، و 1.0 ميكرولتر T7 ligase ، و_{H 2}O حتى الحجم الإجمالي 20.0 ميكرولتر.
   4. امزج جيدا عن طريق سحب العينات وقم بتشغيله في جهاز تدوير حراري باستخدام الإعدادات التالية: قم بتشغيل 50 دورة لاستنساخ 3 و 4 gRNA-concatemers و 25 دورة ل 2 gRNA-concatemers ، كلاهما عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 21 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم 4 درجات مئوية إلى الأبد.
3. علاج نوكلياز خارجي
   ملاحظه: يوصى بشدة بهذه الخطوة لأنها تزيد من كفاءة الاستنساخ عن طريق إزالة أي آثار للحمض النووي الخطي.
   1. عالج تفاعل خلط BbsI باستخدام نوكلياز خارجي الحمض النووي (انظر جدول المواد) على النحو التالي.
   2. خذ 11.0 ميكرولتر مزيج ربط من الخطوة السابقة (2.2.3) ، وأضف 1.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنوكلياز الخارجي (10x) ، و 1.5 ميكرولتر ATP (10 مللي متر) ، و 1.0 ميكرولتر من نوكلياز خارجي الحمض النووي ، وارفع الحجم الإجمالي إلى 15.0 ميكرولتر بالماء. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة متبوعا ب 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ملاحظه: تزيل هذه الخطوة أي حمض نووي خطي متبقي في الخليط وبالتالي تزيد من كفاءة الاستنساخ.
   3. استخدم 2 ميكرولتر من خليط التفاعل للتحول إلى بكتيريا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا عن طريق الصدمة الحرارية.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن تخزين التفاعل لمدة تصل إلى أسبوع عند -20 درجة مئوية.

3. تعداء العضيات المعوية عن طريق التثقيب الكهربائي

ملاحظة: يرجى ملاحظة أن هذا الإجراء يعتمد على البروتوكول الذي نشره Fujii et al. في عام 2015 ، مع التكيف مع المزارع العضوية المعوية الدقيقة للفأر.

1. ما قبل التثقيب الكهربائي
   ملاحظه: يصف هذا القسم كيفية تحضير العضيات المعوية للفأر قبل التثقيب الكهربائي عن طريق إزالة جميع المضادات الحيوية والوسائط المكيفة من وسط الاستزراع. هذا سيمنع الآثار السامة المحتملة أثناء التثقيب الكهربائي.
   1. في اليوم 0 من إجراء التعدي ، قم بتقسيم العضيات بنسبة 1: 2.
      ملاحظة: يمكن الحصول على الثقافات العضوية المعوية عن طريق إجراء عزل القبو وفقا للبروتوكولات المحددة مسبقا. يرجى الرجوع إلى الجدول 2 للاطلاع على جميع مؤلفات الوسائط.
      1. عند تقسيم العضيات للتثقيب الكهربائي ، قم بزرع ما لا يقل عن 6 آبار من صفيحة 48 بئرا لكل تعداد.
      2. قم بزرع العضيات في قطرات مصفوفة 20 ميكرولتر من القاعدة وزراعتها في وسط WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamide) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في حاضنة رطبة (كما هو موضح سابقا).
   2. في اليوم 2 ، قم بتغيير الوسط عن طريق استبدال WENR + Nic ب 250 ميكرولتر من EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (مثبط Glycogen Synthase Kinase-3) + Y-27632 (مثبط ROCK) ، بدون مضادات حيوية (انظر الجدول 2).
      ملاحظة: في جميع الخطوات ، تكون كمية الوسط المضافة إلى كل بئر من صفيحة 48 بئرا 250 ميكرولتر.
   3. في اليوم 3 ، قم بتغيير الوسط العضوي إلى EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25٪ من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، بدون مضادات حيوية.
2. تحضير الخلايا
   ملاحظه: نصف هنا كيفية تقسيم العضيات إلى مجموعات خلايا صغيرة عن طريق التفكك الميكانيكي والكيميائي. هذه الخطوات حاسمة لنجاح الإجراء.
   1. في اليوم 4 ، قم بتعطيل قباب مصفوفة الطابق السفلي باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل وانقل العضيات إلى أنبوب سعة 1.5 مل. محتويات حمام السباحة لأربعة آبار من صفيحة 48 بئرا في أنبوب.
   قم
   2. بتقسيم العضيات ميكانيكيا إلى شظايا صغيرة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P200 حوالي 200 مرة. جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة ، 5 دقائق عند 600 × جم.
   3. قم بإزالة الوسيط وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من البروتياز المؤتلف بدرجة زراعة الخلايا (انظر جدول المواد). احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة أقصاها 5 دقائق ثم تحقق من قطرة 50 ميكرولتر من العينة تحت مجهر ضوئي مقلوب بهدف 4x.
      ملاحظه: من المستحسن وجود مجموعات من 10-15 خلية ، لأن هذا يزيد من بقاء الخلية بعد التثقيب الكهربائي.
   4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب منخفض الارتباط سعة 15 مل وأوقف التفكك بإضافة 9 مل من الوسط القاعدي بدون مضادات حيوية (انظر الجدول 2). جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة ، 5 دقائق عند 600 × جم ، ثم تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط المصل المخفض (انظر جدول المواد).
   5. احسب عدد الخلايا التي تحتوي على حجرة بوركر واستخدم ما لا يقل عن 1 × 10⁵ خلايا لكل تفاعل التثقيب الكهربائي. أضف 9 مل من وسط المصل المخفض إلى أنبوب 15 مل وجهاز الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة ، 3 دقائق عند 400 × جم.
3. التثقيب الكهربائي
   ملاحظه: توفر الأقسام التالية إرشادات حول كيفية إجراء التثقيب الكهربائي وجعل العضيات تتعافى بعد ذلك.
   1. قم بإزالة كل المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في محلول التثقيب الكهربائي (انظر جدول المواد). أضف كمية إجمالية قدرها 10 ميكروغرام من الحمض النووي إلى معلق الخلية وأضف محلول التثقيب الكهربائي إلى الحجم النهائي البالغ 100 ميكرولتر واحتفظ بخليط الحمض النووي للخلية على الجليد. استخدم متجهات CRISPR-concatamer مع بلازميد تعبير Cas9 (على سبيل المثال ، Addgene # 41815) بنسبة 1: 1.
      ملاحظه: يجب أن يكون الحجم الإجمالي للحمض النووي المضاف أقل من أو يساوي 10٪ من إجمالي حجم التفاعل.
   2. قم بتضمين مزيج تعداء منفصل يحتوي على بلازميد GFP لتقييم كفاءة التعدي (على سبيل المثال ، pCMV-GFP ، أو Addgene # 11153 ، أو أي بلازميد عام يعبر عن GFP).
   3. أضف خليط الخلية والحمض النووي إلى كوفيت التثقيب الكهربائي وضعه في حجرة المثق الكهربائي. قم بقياس المعاوقة بالضغط على الزر المناسب على المثقب الكهربائي وتأكد من أنه 0.030-0.055 كيلو أوم. إجراء التثقيب الكهربائي وفقا للإعدادات الموضحة في الجدول 3.
      ملاحظه: إذا كانت قيمة المعاوقة خارج النطاق المسموح به، فاضبط حجم المحلول في الكوفيت.
   4. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي + Y-27632 إلى الكوفيت ثم انقل الكل إلى أنبوب سعة 1.5 مل. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا بالتعافي ثم تدويرها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق عند 400 × جم.
   5. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر / بئر من مصفوفة الطابق السفلي. قم بزرع ما يقرب من 1 × 104 إلى 1 × 105 خلية لكل بئر في صفيحة 48 بئرا وأضف EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25٪ v / v DMSO متوسط. احتضان عند 37 درجة مئوية.
   6. في اليوم 5 ، قم بتغيير الوسيط إلى EN + CHIR99021 + Y-27632 ، وتحقق من كفاءة التعدي من خلال مراقبة تعبير GFP (الشكل 2). احتفظ بالعضيات عند 37 درجة مئوية وقم بتحديث EN + CHIR99021 + Y-27632 المتوسط بعد يومين.
   7. في اليوم 9 ، قم بتغيير الوسيط إلى WENR + Nic + Y-27632 واحتضانه عند 37 درجة مئوية
      ملاحظه: يمكن إزالة Y-27632 بعد 7-10 أيام (في الأيام 16-19).

كاسيت 1 كاسيت 2 كاسيت 3 كاسيت 4 التسلسل (5 ′-3 ′) CACCGG [gRNA1] GT ACCGG [gRNA2] ز CCGG [gRNA3] ACACCGG [gRNA4] GTT التسلسل (5 ′-3 ′) TAAAAC [RC-gRNA1] CC AAAAC [RC-gRNA2] ج AAAC [RC-gRNA3] CTAAAAC [RC-gRNA4] CCG

الجدول 1: الأجزاء المتدلية لكل كاسيت من متجه CRISPR-concatemer.

متوسطة قاعدية التعليقات يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 4 أسابيع وسط زراعة الخلية 500 مل انظر جدول المواد ل-جلوتامين 100 × 5 مل عامل التخزين المؤقت 1 م 5 مل انظر جدول المواد البنسلين ستربتومايسين 100 × 5 مل WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamide) يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين متوسطة قاعدية حتى 50 مل مكمل خال من مصل الخلايا العصبية (50x) 1 مل انظر جدول المواد مكمل غذائي خال من مصل الخلايا العصبية (100x) 500 ميكرولتر انظر جدول المواد ن-أستيل سيستين (500 ملم) 125 ميكرولتر EGF للفأر (100 ميكروغرام / مل) 25 ميكرولتر الماوس Noggin (100 ميكروغرام / مل) 50 ميكرولتر R-Spondin وسط مكيف 5 مل Wnt3a وسط مكيف 25 مل نيكوتيناميد (1 م) 250 ميكرولتر EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين متوسط قاعدي بدون بنسلين ستربتومايسين حتى 20 مل مكمل خال من مصل الخلايا العصبية (50x) 400 ميكرولتر انظر جدول المواد مكمل غذائي خال من مصل الخلايا العصبية (100x) 200 ميكرولتر انظر جدول المواد ن-أستيل سيستين (500 ملم) 50 ميكرولتر EGF للفأر (100 ميكروغرام / مل) 10 ميكرولتر الماوس Noggin (100 ميكروغرام / مل) 20 ميكرولتر Y-27632 (10 ميكرومتر) 20 ميكرولتر CHIR99021 (8 ميكرومتر) 10 ميكرولتر EN (EGF + Noggin) يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 4 أسابيع متوسطة قاعدية حتى 50 مل مكمل خال من مصل الخلايا العصبية (50x) 1 مل انظر جدول المواد مكمل غذائي خال من مصل الخلايا العصبية (100x) 500 ميكرولتر انظر جدول المواد ن-أستيل سيستين (500 ملم) 125 ميكرولتر EGF للفأر (100 ميكروغرام / مل) 25 ميكرولتر الماوس Noggin (100 ميكروغرام / مل) 50 ميكرولتر

الجدول 2: تكوين الوسائط

العضوية. نبض المسام نبض النقل ضغط 175 فولت 20 فولت طول النبض 5 مللي ثانية 50 مللي ثانية الفاصل الزمني للنبض 50 مللي ثانية 50 مللي ثانية عدد النبضات 2 5 معدل الاضمحلال 10٪ 40٪ قطبيه + +/-

الجدول 3: إعدادات التثقيب الكهربائي.

Representative Results

Materials

Optimized CRISPR Design Tool 	Feng Zhang group 		CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/
Webcutter 2.0 			restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) 	New England Biolabs 	M0201L
T4 DNA ligase buffer 	New England Biolabs 	M0202S
T7 DNA Ligase 	New England Biolabs	 M0318L
DTT (dithiothreitol) 	Promega 	P1171
ATP (adenosine triphosphate) 	New England Biolabs 	P0756S
FastDigest BbsI (BpiI) 	Thermo Fisher 	FD1014
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer)	Thermo Fisher 	BY5
BglII 	New England Biolabs 	R0144
EcoRI 	New England Biolabs 	R0101
Plasmid-safe exonuclease 	Cambio 	E3101K
Thermal cycler 	Applied biosystems 	4359659
10G competent E. coli bacteria 	Cambridge Bioscience 	60108-1
Advanced DMEM/F12(cell culture medium)	Invitrogen 	12634-034
Glutamax (L-Glutamine) 	100x Invitrogen 	35050-068
HEPES 1 M (buffering agent) 	Invitrogen 	15630-056
Penicillin-streptomycin 100x 	Invitrogen 	15140-122
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x	Invitrogen 	17504-044
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x	Invitrogen 	17502-048
n-Acetylcysteine 500 mM 	Sigma-Aldrich 	A9165-5G
Mouse EGF 500 μg/mL 	Invitrogen Biosource 	PMG8043
Mouse Noggin 100 μg/mL 	Peprotech	 250-38
Nicotinamide 1 M 	Sigma 	N0636
R-Spondin conditioned medium 	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013
Wnt conditioned medium	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014
Y-27632 10 μM 	Sigma-Aldrich 	Y0503-1MG
Standard BD Matrigel matrix 	BD Biosciences	356231
48-well Plate 	Greiner Bio One 	677980
CHIR99021 	Sigma-Aldrich 	A3734-1MG
IWP-2 	Cell Guidance Systems 	SM39-10
TrypLE (recombinant protease)	 Invitrogen 	12605-010
Opti-MEM (reduced serum medium)	Life technologies	 51985-034
Electroporation Cuvettes 2 mm gap 	NepaGene 	EC-002S
Low binding 15 mL tubes 	Sigma-Aldrich 	CLS430791
Bürker’s chamber 	Sigma-Aldrich	 BR719520-1EA
NEPA21 Super Electroporator 	NepaGene 	contact supplier
Protein LoBind tubes low binding	Thermo Fisher 	10708704
BTXpress electroporation buffer 	Harvard Apparatus 	45-0805
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	 AppliChem	 A3672